[科普中國]-管狀凝膠

梯度凝膠電泳

梯度凝膠電泳分離生物大分子具有分辨力高、條帶清晰的特點(diǎn)，特別適于分離γ-谷氨酞轉(zhuǎn)肽酶一類膜結(jié)合蛋白。此外還可利用濃度梯度聚丙烯酞胺凝膠電泳測定分子量。目前這種方法多是用垂直平板凝膠。下面介紹一套自制管狀梯度凝膠的裝置和制備凝膠的方法。用這種方法，既節(jié)省試劑，又可以裝入任何立式盤電泳槽中，使用也極方便。

梯度發(fā)生器和管狀凝膠制備裝置管狀梯度發(fā)生器與一般梯度發(fā)生器相同，可用有機(jī)玻璃制作。

管狀凝膠制備裝置裝置由厚0.5 cm的有機(jī)玻璃制成。取兩塊14 X 14cm的有機(jī)玻璃板（C板及D板），用圓規(guī)按尺寸準(zhǔn)確分格（共24格）。將舊鋼鋸片兩段捆在一起，在砂輪小溝底板上磨出一把斜形溝刀，用它在C板上相對兩個分點(diǎn)之間過圓心拉出深為0.15 cm的小溝。D板上用鉆在24個分點(diǎn)和圓心上鉆直徑0.7 cm的小孔。再將C, D兩板重疊，分點(diǎn)準(zhǔn)確相對，在四周滴加氯仿粘合。再取24個鏈霉素膠瓶塞，塞膠瓶塞。將玻管插入膠瓶塞的中孔內(nèi)，然后將帶膠塞的玻璃管塞入制凝膠裝置的小孔內(nèi)，即完成裝管工作1。

管狀凝膠的制備按上述方法將玻管全部裝入制膠裝置中，取一條小塑料管，在其一端套上一個鏈霉素膠瓶塞，將瓶塞塞入制膠裝置中心小孔。小塑料管另一端接上一支注射器，注入蒸餾水，驅(qū)趕出管道中的氣泡，然后反抽蒸餾水，待水達(dá)玻璃管底部夾死塑料管再將塑料管接上梯度發(fā)生器。將已配好的4%和30%聚丙烯酞胺溶液分別加入發(fā)生器前后兩圓筒中，開動電磁攪拌器混合前面圓筒中溶液，打開兩圓筒之間和流出口前的夾子，由于發(fā)生器與制膠裝置高度不同，混合好的凝膠可緩緩地流入各個小玻璃管中。如果用電子微動泵控制流速更為理想。當(dāng)凝膠溶液流完（約10分鐘），立即用注射器注入含溴酚藍(lán)的40%蔗糖溶液（注意防止帶入氣泡），當(dāng)紫色液達(dá)小玻管底部后夾死塑料管。待凝膠聚合后就可用來進(jìn)行電泳。

管狀凝膠實(shí)際應(yīng)用舉例曾對人胎肝、腎、胰等組織和膽汁的γ-谷氨酞轉(zhuǎn)肽酶分子量進(jìn)行測定，其方法是將制好的4-30%濃度梯度凝膠管裝入立式電泳槽中，電泳槽加入pH8.9 Tris-HCl凝膠緩沖液，10℃, 70伏電壓預(yù)電泳20-30分鐘。除去凝膠緩沖液再換上pH8.3的Tris-甘氨酸電極緩沖液，分別在小管頂部加入γ-谷氨酞轉(zhuǎn)肽酶樣品和高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，樣品中含20%蔗糖，以溴酚藍(lán)指示。先70伏電泳15分鐘，再升高電壓至220伏，10℃；恒壓電泳3-4小時。電泳后用一般方法剝膠，酶樣品凝膠進(jìn)行酶定位染色，標(biāo)準(zhǔn)蛋白凝膠進(jìn)行蛋白染色。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量對數(shù)值對其相應(yīng)的Rf值作圖得曲線，再由曲線求酶的分子量。由曲線求得人胎肝和膽汁小分子γ-谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶分子量是86000Da2。