[科普中國]-病原菌指示劑

病原菌指示劑的研究應(yīng)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)指示劑

傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)指示劑是通過對從發(fā)病植株分離得到的病原物的形態(tài)學(xué)觀察和利用柯赫氏法則來判斷病原物的種類。

Sinclair（1981）最先提出使用酸性的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌和擬莖點種腐病菌（Sinclair1981）。但由于費事費力，三種病原菌的形態(tài)變化較大，分離的效果不理想。2006年，國內(nèi)張建成等采用種子改良PDA平板培養(yǎng)、常規(guī)豆桿保濕培養(yǎng)結(jié)合的方法首次從美國入境大豆豆桿中成功分離、鑒定出大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌和擬莖點種腐病菌（顧建鋒etal.2006；張建成etal.2006）。2007年，王穎等采用常規(guī)豆桿保濕培養(yǎng)、單孢分離等技術(shù)相結(jié)合的方法鑒定了從美國入境大豆豆桿中分離出的大豆北方莖潰瘍病菌（王穎etal.2007）。采用上述方法雖然可行，但花費的檢測時間太長，且工作量大（要先分離、培養(yǎng)出大量的真菌菌落，從形態(tài)上篩選出疑似菌株），不能滿足口岸快速檢測的需要1。

免疫學(xué)指示劑免疫學(xué)反應(yīng)又稱血清學(xué)反應(yīng)，是指抗原與抗體之間發(fā)生的各種作用?？乖芘c由其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體發(fā)生凝集、沉淀等反應(yīng)，利用病原物中特異性強的抗原與相應(yīng)的抗體反應(yīng)，就能實現(xiàn)對病原物檢測、鑒定。

Gleason等人對大豆擬莖點種腐病菌做了血清學(xué)檢測的研究。用大豆擬莖點種腐病菌的菌絲凍干粉制成抗血清，采用間接ELISA和種子免疫印跡檢測（SIBA）兩種方法檢測大豆種子是否感染擬莖點種腐病菌（Gleasonetal.1987）。實驗結(jié)果表明，兩種方法都能從感染大豆擬莖點種腐病菌的大豆種子上檢測到目標(biāo)菌。間接ELISA的結(jié)果與癥狀的嚴(yán)重程度相關(guān)，而SIBA的結(jié)果與平板生測法的結(jié)果相似。由于被檢測的菌體量發(fā)育能力的不同和評測侵染率的困難度，這兩種檢測方法在實際檢測上的應(yīng)用還是很有限的。

Brill等人利用間接ELISA和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定（DAS-ELISA）對大豆擬莖點種腐病菌的檢測進(jìn)行了研究（Brilletal.1994）。利用大豆擬莖點種腐病菌的培養(yǎng)濾液和菌絲體提取物免疫原在新澤西白兔體內(nèi)制作多克隆抗體。由病原菌培養(yǎng)濾液產(chǎn)生的多功能抗體的特異性比由菌絲提取物產(chǎn)生的多功能抗體的特異性強。DAS-ELISA與間接ELISA相比較特異性強，用來檢測的靈敏度高100倍。

基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的分子指示劑聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴增特定的DNA片段，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法是在該技術(shù)的基礎(chǔ)上建立和發(fā)展起來的，給隨后的科研帶來的革命性的突破。該技術(shù)憑借著強大的生命力被廣泛的運用到了生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)方面的分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究。PCR技術(shù)實現(xiàn)了對基因組直接測序克隆、基因復(fù)制、基因突變檢測、文庫構(gòu)建、差異表達(dá)篩選以及對基因多態(tài)性的檢測。除此之外，疾病的早期診斷和病原物的檢測也在PCR技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用。

分析研究了大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌、擬莖點種腐病菌和大豆莖英莢枯病菌。發(fā)現(xiàn)使用隨機十個堿基的引物425、455都能有PCR產(chǎn)物出現(xiàn)。經(jīng)分析得出使用引物得到的PCR產(chǎn)物條帶中，大豆南方莖潰瘍病菌明顯不同于大豆莖莢枯病菌和大豆擬莖點種腐病菌，將從阿根廷大豆出產(chǎn)區(qū)采集的Phomosis屬菌株分為4個主要類群：大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌、擬莖點種腐病菌和大豆莖莢枯病菌。上述方法使用了大量的引物（探針），所開展的RAPD技術(shù)區(qū)別大豆南方莖潰瘍病菌、大豆北方莖潰瘍病菌、擬莖點種腐病菌和大豆莖莢枯病菌是在形態(tài)學(xué)鑒定完化之后的純菌株基礎(chǔ)上進(jìn)行的。工作量巨大，耗費時間太長，無法解決進(jìn)口大豆中攜帶目標(biāo)病原菌的檢測問題。

國內(nèi)研究方面，2008年趙巍巍等采用TaqManMGB熒光PCR技術(shù)對大豆南方莖潰瘡病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的指示劑進(jìn)行了研究，設(shè)計檢測大豆南方莖潰瘍病菌的引物DM3F/DM3R、探針DM4M和設(shè)計檢測大豆北方莖潰瘍病菌的引物DC2F/DC2R、探針DC2M，研究取得了較好的效果（趙巍巍2008）。與此同時，王穎等（2007）也采用TaqManMGB熒光PCR技術(shù)對大豆南方莖潰瘍病菌和大豆北方莖潰瘍病菌的指示劑進(jìn)行了研究，設(shè)計檢測大豆南方莖潰瘍病菌的引物DM1F/DM1R、探針DM1M和設(shè)計檢測大豆北方莖潰瘍病菌的引物DC2F/DC2R、探針DC2M，研究同樣對兩種病原菌的特異性檢測有較好特異性2。