[科普中國]-色氨酸籠

蛋白質(zhì)折疊

在生物體系中，蛋白質(zhì)折疊是最重要和最具有挑戰(zhàn)性的問題。隨著計算能力的增強，用全原子分子動力學模擬研究蛋白質(zhì)折疊對人們來講已經(jīng)非常普遍。原則上來講，直接的分子動力學模擬能夠提供蛋白質(zhì)folding/unfolding的熱動力學信息，但是直接的計算經(jīng)常受到勢能面上相空間取樣效率問題的阻礙。為了獲得蛋白質(zhì)構(gòu)型空間上完全取樣，發(fā)展了廣義系統(tǒng)算法包括多重正則算，模擬退火算法和副本交換分子動力學（REMD）方法。在那些方法中，REMD方法是模擬蛋白質(zhì)折疊最流行的方法之一。

色氨酸籠設計具有20個殘基的小蛋白Trp-cage（色氨酸籠），由于它非常小并且很容易折疊，使它成為架起理論和實驗橋梁的理想的模型。Trp-cage(TC5B：NLYIQWLKDGGPSSGRPPS;PDBentry1L2Y)是由Neidigh等人設計，包括α-螺旋（殘基2-8）310–螺旋（殘基11-14）多聚脯氨酸II螺旋（殘基17-19）。TC5B中疏水核（兩個脯氨酸和3號絡氨酸）被認為是形成折疊的主要驅(qū)動力。折疊結(jié)構(gòu)被在9號天門冬氨酸和16號精氨酸形成的鹽橋進一步穩(wěn)定。

Simmerling等人用AMBER99力場和普適的波恩溶劑模型（GB）研究發(fā)現(xiàn)在20ns到50ns的動力學模擬中，有一個結(jié)構(gòu)非?？拷麼MR結(jié)構(gòu)，重原子的RMSD是1.4?。Snow等人用OPLS分子力場和GB/SA溶劑模型研究TC5B的折疊比率并且提出了折疊時間范圍從1.5μs到8.7μs。Duan等人用AMBER99分子力場和GB模型研究TC5B的快速折疊機理。從線狀結(jié)構(gòu)出發(fā)，他們模擬出最終結(jié)構(gòu)的主鏈原子與NMR結(jié)構(gòu)主鏈原子的RMSD在1.0?以內(nèi)。Chen等人用CHARMM22/CMAP全原子分子力場和GBSW隱式溶劑模型成功折疊了TC5B。

盡管TC5B的NMR結(jié)構(gòu)已經(jīng)被各種各樣的計算模擬正確預測，但是對TC5B的folding/unfolding的動力學行為的理論模擬并沒有正確的結(jié)論。Pitera等人用AMBER94分子力場和GB/SA溶劑模型進行REMD模擬來研究TC5B的折疊行為，他們計算的熔解溫度大約400K，遠遠高于實驗值315K。Zhou等人用OPLA-AA分子力場和顯式溶劑模型來進行REMD模擬并且發(fā)現(xiàn)熔解溫度在440K左右。Paschek等人發(fā)現(xiàn)折疊的TC5B是太穩(wěn)定，熔解溫度高出實驗值130K。上述那些結(jié)果，在不同的分子力場和不同的溶劑模型下，都顯示了比實驗值更高的熔解溫度。注意上述的那些結(jié)果經(jīng)常依靠分子力場以及所應用的溶劑模型。Shell等人最近研究表明：蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性對所用的分子力場和的溶劑模型是非常敏感的1。

色氨酸籠折疊形成機制的研究進展色氨酸籠的折疊過渡溫度目前國內(nèi)外科研工作者通過核磁共振(NMR)、圓二色(CD)光譜、熒光猝滅光譜(FQCTS)、紫外共振拉曼光譜(URRS)等實驗手段對色氨酸籠的折疊機制都已進行過深入的研究，結(jié)果表明其折疊過程可在1.0-4.1μs范圍內(nèi)完成，該結(jié)果也得到了理論模擬計算的驗證。然而，目前對于色氨酸籠的一些具體的折疊細節(jié)過程仍然存在很大爭議和疑問。例如Qiu等通過跳溫波譜技術(shù)(TJS)研究表明色氨酸籠通過兩態(tài)協(xié)同的方式完成折疊過程；但Neuweiler和Ahmed課題組發(fā)現(xiàn)色氨酸籠并非只是一個簡單的兩態(tài)折疊蛋白；還有一些課題組利用分子動力學模擬方法對Trp-cage的折疊路徑和機理進行研究發(fā)現(xiàn)：Trp-cage折疊轉(zhuǎn)變過程中過渡態(tài)形成的溫度約為400K或更高溫度，未能重復得出實驗所得到的過渡態(tài)的溫度(315K)；而Day、Duan和Zhang等對Trp-cage折疊過程進行的副本交換分子動力學(REMD)模擬發(fā)現(xiàn)，溶解溫度可以和實驗值相吻合。通過分析比較可以推測，這些模擬計算結(jié)果的差異性主要是由于動力學模擬所采用分子力場與溶劑模型的不同?；谶@種模擬計算和實驗研究結(jié)果的不一致，最近O-dziej等采用二維核磁共振技術(shù)與分子動力學模擬相結(jié)合的方法對Trp-cage的折疊過渡溫度進行了研究，結(jié)果表明：由于色氨酸籠折疊復雜性(關(guān)鍵氨基酸Trp6和Pro12的疏水長程協(xié)同作用與N端α-helix解旋過程同時發(fā)生)，其折疊過渡溫度并非在某一溫度時刻，而是在311-317K范圍內(nèi)。

色氨酸籠的折疊形成機制目前對于色氨酸籠折疊過程中各個折疊細節(jié)發(fā)生的順序一直都未達成共識。例如國內(nèi)外一些研究蛋白折疊課題組發(fā)現(xiàn)鹽橋Asp9/Arg16的率先形成對色氨酸籠的折疊發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，然而這恰恰與實驗得到的結(jié)果相反。通過圓二色譜實驗研究發(fā)現(xiàn)，將鹽橋Asp9/Arg16去掉后，色氨酸籠的折疊時間未發(fā)生明顯的變化，并且最近研究也發(fā)現(xiàn)模擬計算起始構(gòu)象中的鹽橋Asp9/Arg16甚至并不能穩(wěn)定存在，在模擬過程中會發(fā)生斷裂消失，并且N端α-helix的穩(wěn)定存在與其形成具有緊密聯(lián)系。Chowdhury和Hu等運用全原子分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)疏水核心Trp6的包埋掩藏是色氨酸籠折疊過程的關(guān)鍵限速步驟，而Juraszek等采用副本交換分子動力學模擬發(fā)現(xiàn)Trp-cage折疊過程的限速步驟并非絕對為疏水核心吲哚環(huán)的包埋，其研究結(jié)果表明色氨酸籠N-端上的α-螺旋結(jié)構(gòu)形成于折疊過程的早期，之后疏水殘基逐漸向疏水核心(Trp6)靠攏，最終疏水核中的Trp6側(cè)鏈上的吲哚環(huán)完整包埋而結(jié)束整個折疊過程。Mok等通過脈沖光譜實驗研究發(fā)現(xiàn)在非折疊態(tài)結(jié)構(gòu)的Trp-cage中存在疏水核結(jié)構(gòu)，說明疏水核的塌陷推動蛋白結(jié)構(gòu)的整個折疊進程，即所謂的疏水塌陷模型。Trp-cage這種疏水塌陷折疊模型的提出也得到了其他課題組的支持，而Ahmed課題組發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)中N端的α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成先于疏水核的塌陷，Juraszek課題組卻認為Trp-cage的折疊形成遵循成核-聚集和擴散-碰撞模型?？梢姡m然色氨酸籠只有20個氨基酸組成，且其結(jié)構(gòu)簡單緊湊且折疊迅速，但其折疊機制仍然存在爭議。為了探究該色氨酸籠復雜的折疊過程，我們曾采用溫控分子動力學(TCMD)方法對色氨酸籠在真空和水溶劑條件下的折疊與解折疊過程進行了深入的研究，得到了Trp-cage折疊過程中的重要中間態(tài)結(jié)構(gòu)，為其折疊與解折疊機制的揭示提供了直接、可靠的依據(jù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶劑水分子可通過疏水作用誘導Trp-cage形成一個亞穩(wěn)態(tài)(MSOL)和一個非天然態(tài)疏水核的過渡態(tài)(TS)結(jié)構(gòu)，推動肽鏈疏水殘基間的相互作用，進而促進肽鏈結(jié)構(gòu)疏水核的快速收縮和正確折疊。為深入理解Trp-cage天然折疊態(tài)構(gòu)型的穩(wěn)定形成機制，我們采用分子動力學結(jié)合殘基點突變(甘氨酸替換)的方法研究Trp-cage中各個氨基酸側(cè)鏈基團在其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用，通過與野生天然態(tài)蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性特征數(shù)據(jù)對比，確定了每個殘基側(cè)鏈在其整個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用。如殘基Tyr3與Pro19間的疏水作用、殘基Ser14和Arg16間的氫鍵作用以及Pro17所形成的三級天然接觸等穩(wěn)定作用對Trp-cage整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起著特殊重要的作用。另外，具有相同側(cè)鏈的氨基酸殘基(Ser13和Ser14)由于其側(cè)鏈所處位置的不同導致其對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的貢獻程度也不同；鹽橋在模型多肽結(jié)構(gòu)中本身穩(wěn)定性非常高，不易被突變所破壞。這些結(jié)果為理解色氨酸籠折疊構(gòu)型的穩(wěn)定形成機制提供了重要的理論依據(jù)2。