[科普中國]-金屬螯合染料

定義

金屬螯合染料是與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過程兼容。這些染色不包含影響表征過程的其他試劑如戊二醛、甲醛或Tween一20。發(fā)光金屬螯合染料很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)相結(jié)合，包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀。最為靈敏的發(fā)光染料—SYPRO Ruby比最好的堿性二氨銀和酸性硝酸銀染色的靈敏度高，且線性范圍寬。1

分類比色金屬螯合染料最早報(bào)道的用于凝膠電泳蛋白質(zhì)檢測(cè)的金屬螯合劑為紅菲繞啉二磺酸鹽/亞鐵復(fù)合物。報(bào)道其靈敏度大約在600ng。由于它較已經(jīng)實(shí)踐應(yīng)用的考馬斯藍(lán)染色沒有明顯優(yōu)勢(shì)，因而沒得到廣泛認(rèn)可。將放射性59Fe引入紅菲繞啉二磺酸鹽復(fù)合物可以檢測(cè)到10～25ng蛋白質(zhì)，但按今天的標(biāo)準(zhǔn)也只是和膠體考馬斯藍(lán)的靈敏度接近，放射性環(huán)境下工作的危害性和獲準(zhǔn)使用放射性同位素所增加的麻煩排除了其廣泛使用的可能性。酞菁四磺酸酮金屬螯合物，可以在進(jìn)行PAGE膠染色時(shí)達(dá)到與標(biāo)準(zhǔn)考馬斯藍(lán)染色相同的靈敏度。該染料也可用于固定在硝酸纖維素上蛋白質(zhì)的染色，其檢測(cè)限在10～20ng蛋白質(zhì)。

雖然靈敏度稍低，氨基黑、麗春紅S和考馬斯藍(lán)仍是最常用的檢測(cè)轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)的方法，因?yàn)樗鼈兣c下游微量化學(xué)表征技術(shù)兼容。我們的研究小組針對(duì)靈敏度問題設(shè)計(jì)了一系列金屬螯合染料以檢測(cè)轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)。在Chung成功地用ferreneS檢測(cè)PAGE膠內(nèi)鐵結(jié)合蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，我們推測(cè)如果外加的亞鐵離子附著在蛋白質(zhì)上，如果遇到鐵指示劑如ferrene S或鋅鐵，在轉(zhuǎn)印膜上即可得到全蛋白質(zhì)顯色圖。我們優(yōu)化了方法，簡化到只要在轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)孵育前混合亞鐵離子和螯合劑即可，但直到發(fā)表時(shí)我們?nèi)源_信與蛋白質(zhì)的結(jié)合主要由金屬離子獨(dú)自調(diào)節(jié)完成。在開發(fā)可替代性金屬螯合染料的過程中篩選了大量金屬螯合物后我們才意識(shí)到與蛋白質(zhì)的結(jié)合是由金屬螯合物上的磺酸基團(tuán)所介導(dǎo)的，因此，金屬螯合染料與1978年開發(fā)的紅菲繞啉二磺酸鹽/亞鐵染料屬于同一家族。

鋅鐵/亞鐵和焦酚紅/鉬酸鹽染料的靈敏度和氨基黑不相上下，通?？梢詸z測(cè)到20—50ng蛋白質(zhì)。鋅鐵/亞鐵染色的優(yōu)點(diǎn)是通過增加溶液pH值可以容易脫色，并且可以很容易地在鋅鐵/亞鐵溶液中孵育來加強(qiáng)信號(hào)，此時(shí)其檢測(cè)限可達(dá)到5～10ng蛋白質(zhì)。金屬螯合染料還和Edman測(cè)序、質(zhì)譜和免疫印漬兼容。1

發(fā)光金屬螯合染料由于對(duì)比色染料的檢測(cè)靈敏度不太滿意，我們對(duì)發(fā)光金屬螯合染料進(jìn)行了研究。從原理上講，檢測(cè)光散射要比檢測(cè)光吸收靈敏一些，由于光吸收受有色復(fù)合物摩爾消光系數(shù)的限制，因此，利用金屬螯合物與特定過渡金屬離子如銪、鋱、釕、錸復(fù)合而形成的發(fā)光蛋白質(zhì)染料，與上述比色法相比可以得到更高靈敏度。

紅菲繞啉二磺酸鹽/銪(SYPRO Rose Protein Blot stain，Molecular Probes，Eugene，OR)是一種中等靈敏度的染料。通常可以檢測(cè)到由狹縫印漬所得的2～4ng/mm2的蛋白質(zhì)上樣量。依據(jù)常規(guī)的電轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)，該數(shù)值轉(zhuǎn)換成膠內(nèi)上樣為15到30ng。該染料的顯色可以用300rim紫外表面照射而在590nm和615nm發(fā)射。在中性或弱堿性環(huán)境中孵育可以洗脫染料。由于與免疫印漬、凝集素印漬、Edman測(cè)序和質(zhì)譜的兼容性，使SYPRO Rose染料成為近乎與麗春紅S染料一樣簡便而優(yōu)良的常規(guī)蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑。其缺陷是可以對(duì)核酸像蛋白質(zhì)一樣進(jìn)行染色，脫色步驟很像傳統(tǒng)考馬斯藍(lán)染色，許多激光凝膠掃描儀不能用，因?yàn)樵撊玖喜荒鼙豢梢姽饧ぐl(fā)。

SYPRO Ruby是一種專利的基于釕的金屬螯合染料，其開發(fā)是為了彌補(bǔ)SYPRODRose染料的缺陷。SYPRO Ruby蛋白印漬染料(Molecular Probes，Eugene，OR)可以對(duì)硝酸纖維素或PVDF轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)永久染色，在狹縫印漬時(shí)其檢測(cè)靈敏度為0.25～lng/mmz，常規(guī)大約2～8ng的蛋白質(zhì)可通過電轉(zhuǎn)印檢測(cè)，對(duì)照比較實(shí)驗(yàn)證實(shí)它具有和膠體金染色一樣的靈敏度(AuroDye，Amersham Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL)。而膠體金染色需要2～4h，SYPRO Ruby染料染色在15 rain內(nèi)即可完成。SYPRORuby蛋白印漬染色的動(dòng)態(tài)線性范圍大大優(yōu)于膠體金染色，擴(kuò)展了約1000倍。該染料可用300nm紫外透射儀激活或利用裝配有450、473、488乃至532nm激光的成像系統(tǒng)。不像膠體金染色，SYPRO Ruby染料不干擾質(zhì)譜或免疫檢測(cè)過程，又與SYPRO Rose不同，它對(duì)核酸不染色。1

優(yōu)勢(shì)SYPRO Rubv 2一DE和IEF染色僅需一步即可獲得PAGE內(nèi)蛋白質(zhì)的低背景染色，而且不需要進(jìn)行長時(shí)間脫色步驟。這些染料的線性動(dòng)態(tài)范圍擴(kuò)展到超過三個(gè)數(shù)量級(jí)之大，在性能上超過了銀染和考馬斯藍(lán)染色，對(duì)等電點(diǎn)從3.5到9.3范圍的11個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)估表明SYPRO Ruby IEF凝膠染色的靈敏度比高靈敏銀染要高3～30倍。2

缺陷用銀染效果很差的蛋白質(zhì)往往用SYPRO Ruby染料很容易檢測(cè)到。雖然比SYPRO Orange和Red染料更為靈敏，其最佳染色要稍慢一些，約需4h。與膠體考馬斯藍(lán)染料類似，但與銀染不同，SYPRO Ruby染料的染色是終點(diǎn)式(end—point)染色，因此，染色時(shí)間不嚴(yán)格，可以過夜染色且不會(huì)顯色過度。2