[科普中國(guó)]-理性分子設(shè)計(jì)

發(fā)展簡(jiǎn)介

20 世紀(jì) 90 年代以后，計(jì)算能力和分子模擬技術(shù)的高速發(fā)展使研究者能夠從微觀的角度認(rèn)識(shí)分子之間的作用模式，以及結(jié)合過(guò)程中力和能量的變化，為高親和性配基的篩選提供了一條新的途徑。分子模擬軟件融合了最先進(jìn)的計(jì)算機(jī)軟硬件與圖形技術(shù)，集成了計(jì)算化學(xué)和分子圖形學(xué)的最新成果，并將化學(xué)信息管理系統(tǒng)作為其貫穿整個(gè)軟件的基礎(chǔ)。它能在三維水平上了解化合物的分子結(jié)構(gòu)和各種重要的微觀性質(zhì)（如靜電勢(shì)、疏水場(chǎng)等）與所期望的宏觀性質(zhì)（如親和性）之間的定量關(guān)系。利用分子模擬軟件對(duì)配基與生物大分子之間的親和性進(jìn)行預(yù)測(cè)，能夠提高合成化合物的命中率，減少化合物的合成數(shù)目，雙向降低合成與篩選的成本，縮短研究與開發(fā)的周期，因此具有強(qiáng)大的經(jīng)濟(jì)效益。1993 年 Lowe 等根據(jù)胰蛋白酶類似物活性部位氨基酸殘基與精氨酸和賴氨酸的親和作用，首次利用理性設(shè)計(jì)的方法對(duì)染料配基進(jìn)行改造，大大提高了其親和性。此后，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)人員開展了應(yīng)用理性設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行高親和性配基的篩選研究。

配基的理性設(shè)計(jì)借助于計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)，整合了天然蛋白質(zhì)分子的特異性和合成配基在穩(wěn)定性方面的各種優(yōu)點(diǎn)，為高親和性配基的篩選提供了一條新的思路，成為最具生命力的設(shè)計(jì)方法。理性設(shè)計(jì)親和配基的研究歷史雖然較短，但其發(fā)展對(duì)于親和色譜技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用有著重要的意義。目前常用的配基理性設(shè)計(jì)方法共有以下三種：基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)方法，基于功能的理性設(shè)計(jì)方法以及理性設(shè)計(jì)結(jié)合組合庫(kù)技術(shù)的方法1。

基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)方法基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)方法是在自然界中存在的配基或目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，利用分子模擬軟件改進(jìn)或開發(fā)一種新的與目標(biāo)蛋白具有更高親和力的配基。近年來(lái)，生物信息學(xué)和計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)的飛速發(fā)展為蛋白質(zhì)功能和高級(jí)結(jié)構(gòu)的解析提供了更為廣闊的平臺(tái)。截至 2008 年 7 月，已有 51, 000 個(gè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)信息利用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得，這些信息都存儲(chǔ)在美國(guó) Brookheaven 構(gòu)建的蛋白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （ Protein Data Bank, PDB ）（http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do）中，供全世界的研究人員免費(fèi)下載。

為基于目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用計(jì)算機(jī)理性設(shè)計(jì)親和配基提供了便利，使其成為更加快速的獲得高親和性肽配基的有效方法。該方法一般包括以下步驟：

1． 通過(guò)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)或同源模建的方法獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。

2． 基于經(jīng)驗(yàn)或分子模擬軟件分析找到潛在的配基結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)可能是蛋白質(zhì)的活性點(diǎn)，也可能是它的天然互補(bǔ)配基結(jié)合位點(diǎn)，或者是溶劑暴露區(qū)域等。

3． 建立一個(gè)含有大量候選分子的數(shù)據(jù)庫(kù)，也可以利用商業(yè)化的數(shù)據(jù)庫(kù)，如常用的劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Cambridge Structural Database，CSD）和現(xiàn)有化學(xué)品目錄數(shù)據(jù)庫(kù)（Available Chemicals Directory，ACD）等。

4． 利用分子對(duì)接軟件（FlexX, Dock, Autodock 等）進(jìn)行配基的篩選，獲得與目標(biāo)蛋白具有較高親和性的配基。

5． 最后利用分子顯示和分子性質(zhì)分析軟件評(píng)價(jià)所獲得的配基和目標(biāo)蛋白的親和性。

利用基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)方法篩選親和配基的研究已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展。Baumann 等利用分子模擬在豬胰腺 α-淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上利用分子對(duì)接軟件從含有 53 個(gè)芳基的糖類化合物中篩選出 23 個(gè)候選化合物，然后利用核磁共振技術(shù)進(jìn)一步篩選獲得一個(gè)與該目標(biāo)蛋白具有較高親和性的化合物，合成并固定化此肽配基制得親和層析柱，利用同源建模的序列分析獲得了人單克隆抗體片段的三維結(jié)構(gòu)，然后利用分子對(duì)接軟件從 ACD 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出 24 個(gè)化合物作為候選分子，再利用表面等離子共振和 STD-NMR 技術(shù)進(jìn)一步篩選獲得與目標(biāo)蛋白具有高親和性的配基，最后利用親和色譜驗(yàn)證了該配基與單克隆抗體片段的親和性。另外，如果已知待研究的目標(biāo)蛋白-自然配體復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，也可以從已知的與待分離的生物大分子具有親和作用力的配體小分子出發(fā)，通過(guò)結(jié)構(gòu)改造、修飾等方法獲得親和力更高的配基。Platis 等以鎖鑰原理為基礎(chǔ)理性設(shè)計(jì)了人艾滋病毒單克隆抗體 2F5 的親和配基，同時(shí)利用親和色譜實(shí)驗(yàn)證明了該配基與目標(biāo)蛋白具有較高的親和力1。

基于功能的理性設(shè)計(jì)方法如果待分離目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)未知或也不能通過(guò)同源建模技術(shù)獲得，則可以采用基于功能的理性設(shè)計(jì)方法來(lái)設(shè)計(jì)目標(biāo)蛋白的親和配基。該方法是在自然界中存在的親和作用體系的基礎(chǔ)上，利用已知的配體或抑制劑的功能基團(tuán)來(lái)設(shè)計(jì)新的親和配基。利用基于功能的理性設(shè)計(jì)方法篩選肽配基有兩種途徑：一種途徑是通過(guò)研究目標(biāo)蛋白的底物、抑制劑或輔酶的形狀或物理化學(xué)性質(zhì)（疏水性，靜電勢(shì)）來(lái)設(shè)計(jì)一種與目標(biāo)蛋白具有高親和性的配基；另外一種途徑是在目標(biāo)蛋白的活性部位所暴露殘基的基礎(chǔ)上，根據(jù)理化性質(zhì)互補(bǔ)的原則或引進(jìn)一些特殊的功能基團(tuán)來(lái)理性設(shè)計(jì)配基。因此，該方法的實(shí)質(zhì)是在經(jīng)驗(yàn)知識(shí)的基礎(chǔ)上模仿自然界中存在的配體。例如，氨苯磷酸鹽是堿性磷酸酯酶的親和配基，而芐脒基團(tuán)常被用來(lái)作為配基來(lái)分離純化胰蛋白酶類蛋白酶，Burton 等利用該思路針對(duì)舒緩激肽設(shè)計(jì)了特異的親和配基，利用分子模擬軟件 Macromodel研究了結(jié)合于酶活性部位的二肽 Cys-Lys 與酶的相互作用模式，以 Phe-Arg 二肽為模板設(shè)計(jì)出以苯甲脒和苯丙氨酸為活性端，以三氮嗪環(huán)為母體化合物的親和配基，其大小、形狀、極性特征與模板二肽相當(dāng)，能很好的結(jié)合于受體活性部位，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種配基能從胰腺粗提取物中特異結(jié)合舒緩激肽而不結(jié)合胰蛋白酶和凝乳蛋白酶，其純化倍數(shù)達(dá)到 110 倍1。

結(jié)合理性設(shè)計(jì)和組合庫(kù)技術(shù)的方法與大規(guī)模的組合庫(kù)篩選技術(shù)以及完全基于目標(biāo)蛋白或配體的結(jié)構(gòu)或功能信息和設(shè)計(jì)者經(jīng)驗(yàn)的親和配基設(shè)計(jì)方法相比，結(jié)合理性設(shè)計(jì)和組合庫(kù)技術(shù)篩選配基已經(jīng)成為一種更加高效和理性的篩選方法。它首先利用計(jì)算機(jī)的分子模擬技術(shù)獲得目標(biāo)蛋白或其自然配體的盡可能詳盡的結(jié)構(gòu)信息，把合成的注意力更多地集中在具有相關(guān)結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性的潛在配體上，以此構(gòu)成一個(gè)小規(guī)模的配體庫(kù)用于實(shí)驗(yàn)篩選，研究人員可以從中獲得親和性較高的配體；同時(shí)，通過(guò)分析篩選結(jié)果與配體結(jié)構(gòu)的定性關(guān)系獲得一些更為直觀的經(jīng)驗(yàn)，用于指導(dǎo)配體化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。由于單純的規(guī)模化篩選目的性不強(qiáng)，篩選結(jié)果很大程度上取決于所建肽庫(kù)的容量和質(zhì)量；而單純的計(jì)算機(jī)輔助的設(shè)計(jì)過(guò)程不能將隨后的配基固定化過(guò)程以及復(fù)雜的化學(xué)環(huán)境、動(dòng)態(tài)的結(jié)合模式等諸多可變因素考慮在內(nèi)。

目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能信息與組合配體庫(kù)和高效篩選方法的結(jié)合，在很大程度上彌合了經(jīng)驗(yàn)與實(shí)際過(guò)程之間的偏差，這種設(shè)計(jì)思路將對(duì)親和色譜的規(guī)?；瘧?yīng)用產(chǎn)生積極的影響?；谶@種方法的配基篩選過(guò)程一般包括以下步驟：

1．在目標(biāo)蛋白三維結(jié)構(gòu)（利用 X-ray，NMR 或同源建模獲得）或功能的基礎(chǔ)上選擇合適的結(jié)合位點(diǎn)。

2．利用分子模擬軟件理性設(shè)計(jì)一些與目標(biāo)蛋白結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)片段。

3．以這些結(jié)構(gòu)片段為先導(dǎo)片段利用組合庫(kù)技術(shù)（固相合成技術(shù)）來(lái)合成一系列的候選化合物。

4．以目標(biāo)蛋白為靶標(biāo)篩選與其具有高親和性的配基。

5．合成該配基，固定化后制得親和層析柱，利用其來(lái)分離目標(biāo)蛋白。若其親和分離效果不好，重復(fù)第四步進(jìn)行重新篩選。

Lowe 研究組已經(jīng)利用這種方法開發(fā)出一系列的三嗪類似物的配基。Roque等首先利用分子模擬工具分析了前導(dǎo)蛋白質(zhì)L和人抗體輕鏈之間的相互作用，利用理性設(shè)計(jì)的方法獲得了與抗體或其小片段（Fab 或 scFv）具有親和作用的12 個(gè)先導(dǎo)化合物分子，然后利用固相合成技術(shù)生成一個(gè)化合物庫(kù)，通過(guò)篩選獲得與目標(biāo)蛋白具有高親和性的化合物。合成并固定化該化合物制得親和層析柱，用于人免疫球蛋白 G 木瓜蛋白酶消化液中 Fab 的分離純化，純度達(dá)到 96~98%。Melissis 研究小組利用該技術(shù)成功地設(shè)計(jì)了與 Pfu DNA 聚合酶和 Taq DNA 聚合酶的核苷酸類似物配基，并獲得了非常好的分離效果1。

理性設(shè)計(jì)提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的策略對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造的傳統(tǒng)方法為定向進(jìn)化，即在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然界的進(jìn)化過(guò)程，首先針對(duì)某一蛋白質(zhì)的基因，通過(guò)特定的誘變與重組技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，構(gòu)建突變文庫(kù)，然后再根據(jù)突變體的熱穩(wěn)定性的狀況，篩選出熱穩(wěn)定性較好的突變體。該方法不需要考慮蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，但是需要構(gòu)建大規(guī)模的突變體庫(kù)，并且需要建立靈敏有效的高通量篩選方法，因此往往會(huì)耗費(fèi)大量的人力、物力及財(cái)力。而隨著人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的深入，大量的熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)以及對(duì)影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性機(jī)制的了解，使得人們期待著采用一種理性設(shè)計(jì)的策略對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行合理性設(shè)計(jì)而改變其熱穩(wěn)定性。所謂蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)是基于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的認(rèn)識(shí)，通過(guò)定點(diǎn)飽和突變技術(shù)改造蛋白質(zhì)的一種方法。

進(jìn)行蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)意味著在突變之前，人們需要進(jìn)行仔細(xì)的考慮與推測(cè)，選擇特定位點(diǎn)進(jìn)行突變。該個(gè)方法通常要求有蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，并且要求對(duì)蛋白質(zhì)的催化機(jī)理、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系以及酶的熱穩(wěn)定性機(jī)制有深入的了解。由于人的理性參與，可以在較短的時(shí)間內(nèi)設(shè)計(jì)并得到性質(zhì)改善的突變體。理性設(shè)計(jì)獲得的結(jié)果可以反過(guò)來(lái)擴(kuò)充人們對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)。但是由于目前人們對(duì)酶的催化機(jī)制以及酶熱穩(wěn)定性機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限，理性設(shè)計(jì)的應(yīng)用范圍受到很大的限制。到現(xiàn)在為止應(yīng)用比較成功的方法主要有以下幾種2:

同源比對(duì)的策略研究發(fā)現(xiàn)，在嗜熱蛋白質(zhì)與其同源的中溫蛋白質(zhì)之間往往具有較高的相似性( 通?？蛇_(dá)到40% ～ 80%) ，因此，可以通過(guò)比較熱穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)與熱穩(wěn)定差的蛋白質(zhì)的序列，找出與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，然后對(duì)其進(jìn)行突變，進(jìn)而可以提高中溫蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。其中嗜熱蛋白質(zhì)可以為來(lái)源于已知熱穩(wěn)定性質(zhì)的蛋白質(zhì)的同源蛋白或來(lái)源于嗜熱菌基因組中編碼的同源蛋白。應(yīng)用同源比對(duì)策略，通過(guò)比較來(lái)源于Xanthomonas campestris 的中溫果膠裂解酶( pectate lyase) 與4 條嗜熱果膠裂解酶的序列，發(fā)現(xiàn)這4 個(gè)嗜熱果膠裂解酶的序列相同，但其與中溫果膠裂解酶序列不同，主要集中在9 個(gè)位點(diǎn)。通過(guò)將中溫果膠裂解酶中的這9 個(gè)位點(diǎn)突變成嗜熱果膠裂解酶中的氨基酸，結(jié)果顯示有6 個(gè)突變體的半衰期比野生型增長(zhǎng)，其中有一個(gè)單點(diǎn)突變R236F 的半衰期是野生型蛋白質(zhì)的23 倍。

蛋白質(zhì)表面電荷的優(yōu)化策略蛋白質(zhì)通常是在內(nèi)部形成一個(gè)疏水核心，而在其表面分布著一些帶電荷的氨基酸，這些分布在蛋白質(zhì)表面的帶電荷氨基酸之間可以通過(guò)電荷之間的相互作用，給蛋白質(zhì)形成一個(gè)保護(hù)網(wǎng)，增加蛋白質(zhì)對(duì)高溫的抗性。因此通?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)蛋白質(zhì)表面帶電荷的氨基酸進(jìn)行重新設(shè)計(jì)優(yōu)化，使其表面的電荷分布更加合理，從而提高其熱穩(wěn)定性?，F(xiàn)已有研究人員設(shè)計(jì)出Modeller 軟件可用于計(jì)算蛋白質(zhì)表面電荷的分布狀況，模擬蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及突變體的結(jié)構(gòu)，用遺傳算法來(lái)篩選最優(yōu)的表面帶電荷氨基酸的分布。

該軟件現(xiàn)已應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的改良，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些表面電荷重新設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性較野生型蛋白質(zhì)均有一定的提高，表明該方法有一定的適用性。

基于二硫鍵的設(shè)計(jì)策略在蛋白質(zhì)特定位置上的二硫鍵可以對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用。它主要通過(guò)降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵值來(lái)達(dá)到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的。通過(guò)認(rèn)真分析二硫鍵中各個(gè)原子之間的距離及鍵角等相關(guān)信息，可知在蛋白質(zhì)的二硫鍵中，Cβ-Sγ-Sγ之間的鍵角為104. 15°。利用該信息設(shè)計(jì)的二硫鍵設(shè)計(jì)軟件( Disulfide by Design) ，可以分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中哪些氨基酸之間可能會(huì)形成二硫鍵，并進(jìn)而通過(guò)在蛋白質(zhì)的特定位置引入二硫鍵提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

溫度因子的設(shè)計(jì)策略溫度因子( B-factor) 的概念起源于晶體研究，主要是用來(lái)體現(xiàn)晶體中原子構(gòu)象狀態(tài)的一種“模糊度”( diffusion) 。這個(gè)“模糊度”實(shí)際上反映了蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象狀態(tài)。B-factor 越高，“模糊度”越大，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定或柔性越強(qiáng)。在晶體學(xué)數(shù)據(jù)中，B-factor 一般是以原子為單位給出的，通常我們將其換算成相應(yīng)氨基酸殘基的B-factor，從而可以分析氨基酸殘基的構(gòu)象穩(wěn)定性或其柔性。研究發(fā)現(xiàn)，將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中B-factor 值較高的氨基酸突變后，部分突變體的熱穩(wěn)定性可以得到明顯的提高。因此有些研究也利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)預(yù)測(cè)B-factor，從而輔助突變位點(diǎn)的設(shè)計(jì)。

SCHEMA 模擬法DNA shuffling 是一種有效的非理性設(shè)計(jì)方法，它可以將多個(gè)有益突變?nèi)诤掀饋?lái)，形成一個(gè)更加完美實(shí)用的分子。SCHEMA 模擬法由Voigt等于2002 年提出，它的思路正是來(lái)源于這種DNA 隨機(jī)重組的方法，該方法通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，將蛋白質(zhì)分成若干個(gè)獨(dú)立的小模塊，使小模塊之間的相互影響減少到最小，并利用該信息來(lái)確定蛋白質(zhì)之間可以進(jìn)行重組的位點(diǎn)。通過(guò)該方法可以將嗜熱蛋白質(zhì)中和嗜熱相關(guān)的模塊引入到中溫蛋白質(zhì)，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。該方法已成功的應(yīng)用到纖維素酶的分子改良。