[科普中國]-正相色譜

定義

液相色譜有正相和反相之分。正相色譜和反相色譜還有吸附色譜和極性化學(xué)鍵鍵合色譜之分。如果采用固定相的極性大于流動相的極性，就稱為正相色譜；如果固定相的極性小于流動相的極性，則稱為反相色譜。由于極性化合物更容易被極性固定相所保留，所以正相色譜系統(tǒng)一般適用于分離極性化合物，極性小的組分先流出。相反，反相色譜系統(tǒng)一般適用于分離非極性或弱極性化合物，極性大的組分先流出。另外，其他有些色譜如柱色譜也有正反相之分。正相色譜主要適用于非極性至中等極性的中小分子化合物的分離，在生化分析中主要應(yīng)用于脂溶性維生素、甾體激素、醫(yī)藥等的分離分析；在農(nóng)藥、石油化工、精細(xì)化工、環(huán)境分析等方面也有廣泛的應(yīng)用。

正相色譜基本上可以被看做是液固吸附色譜，其柱填料是吸附劑，其表面上分布有活性吸附位點，溶劑和溶質(zhì)分子均能被吸附于活性位點上。由于相互作用力有大有小，溶劑分子與溶質(zhì)分子、溶質(zhì)分子相互之間又存在競爭吸附，從而造成了在柱內(nèi)保留時間的差異，使不同物質(zhì)得到分離。1

適合樣品正相色譜一般用來分離中性化合物和離子(或可電離的)化合物，而且以中性樣品為主。適于分離樣品如下：①對于反相色譜法很難分離的異構(gòu)體，可以采用以硅膠為固定相的正相色譜分離分析；②根據(jù)被分離樣品極性差別進(jìn)行族類分離；③易于水解樣品的分離分析；④分離分析高脂溶性樣品，其在極性有機(jī)溶劑中溶解度很??；⑤正相色譜也可以用于異構(gòu)體分離(包括幾何異構(gòu)體和光學(xué)異構(gòu)體)。表8—13列出了正相色譜的主要特征[8l。表8一13正相色譜的主要特征1

原理正相色譜是采用極性固定相(如帶有二醇基、氨基、和氰基的固定相及硅膠、三氧化二鋁等)、非極性流動相(如正己烷等)的分離方法。這是一種根據(jù)分子的極性大小將其分開的液相色譜技術(shù)，因為正相色譜以吸附效應(yīng)作為分離的基礎(chǔ)，所以也稱為吸附色譜。在正相色譜中，樣品分子與載體基質(zhì)的硅醇基團(tuán)發(fā)生特異的極性相互作用，與固定相產(chǎn)生強極性相互作用的極性樣品分子比較難被洗脫，在柱內(nèi)停留比較長的時間，反之，極性較弱或非極性分子與硅膠之間產(chǎn)生相對較弱的相互作用，比較容易被洗脫，因而在柱內(nèi)停留的時間較短。因此，正相色譜可以根據(jù)溶劑極性差別而達(dá)到分離的目的。

正相色譜的保留機(jī)理類似于吸附過程。極性樣品分子和溶劑分子吸附在柱填料表面的極性基團(tuán)(吸附劑)上。對于正相中經(jīng)常選用的氰基、氨基或二醇基固定相柱，吸附位點通常為鍵合相配體或硅烷醇。在使用硅膠時，吸附位點為硅烷醇(一SiOH)。極性樣品分子一般包含連接在烴基(如苯基或己基)上的一種或多種極性官能團(tuán)。非極性樣品在吸附位點上的吸附力非常弱；但對于一些強極性化合物，也會由于其與固定相的相互作用非常強烈而導(dǎo)致分離效率較差，使得峰形嚴(yán)重拖尾。2

填料的種類與性質(zhì)優(yōu)良的正相色譜填料，應(yīng)當(dāng)具有以下基本特性：

①表面具有極性活性基團(tuán)即吸附位點；

②具有適宜形狀，最好呈微米級微球形，且粒徑分布均勻；

③具多孔性并有高比表面積，以承載較大的樣品負(fù)荷；

④在操作條件下化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；

⑤具有高機(jī)械強度；

⑥價格合理且可穩(wěn)定供應(yīng)。3

硅膠在吸附色譜中最常用的填料是硅膠，此外氧化鋁和極性鍵合相硅膠亦是重要的正相填料。Al2O3，對于不飽和化合物，特別是芳香族化合物多核芳烴，保留能力較強，芳烴異構(gòu)體可以得到良好分離；此外當(dāng)樣品為堿性化合物時，若使用硅膠則會造成嚴(yán)重吸附，溶質(zhì)峰拖尾或難以洗脫，此時宜選用Al2O3進(jìn)行分離。

硅膠的吸附選擇性可以表現(xiàn)為多種形式，如分子量或分子尺寸選擇性、功能團(tuán)選擇性、形狀選擇性、異構(gòu)體選擇性以及生化選擇性等，影響吸附劑選擇性的參數(shù)有：比表面積、平均孔徑和表面活性。

表面活性是正相色譜中作為填料的硅膠的一個重要參數(shù)，它主要依賴于表面硅羥基的類型、分布及其反應(yīng)性。完全羥基化的表面具有最大的反應(yīng)性，表面吸附的水或其他極性化合物，即使是極少量也會明顯地降低表面活性。此外，比表面積相對較低的大孔硅膠，其表面硅羥基的分布一般較為均一。這是因為，在它們的制造過程中，通過熱處理或燒結(jié)已使其無定形表面部分地具有能晶形的特征。微孔硅膠的表面不確定性較高，故其表面活性比大孔硅膠要高。1

極性鍵合相填料極性鍵合相系以硅膠為基質(zhì)，表面鍵合以極性基團(tuán)，如一NH基、一CN基、一CH(OH)一CH2OH基以及一N02基等而制成的填料，分別稱為氨基、氰基、二醇基及硝基鍵合相填料，但其配基濃度一般較反相為低。依據(jù)表面修飾試劑和反應(yīng)條件的不同，表面修飾層的濃度約在2～4 mol/m2。

極性鍵合相的配基比較復(fù)雜，因此在不同的流動相中會顯示出不同的特性。在非極性溶劑中，極性基團(tuán)(如一NH2和一NH一等)主導(dǎo)與溶質(zhì)的相互作用；而在極性溶劑中，配基的非極性鏈段的作用增強。當(dāng)在水溶液體系中工作時，配基中的氨基在pH7。因此與硅膠相比，上述極性化學(xué)鍵合相填料屬于中等極性填料。此外，由于有機(jī)配基對于硅膠表面的修飾，掩蔽了具有極高活性的硅羥基，使得極性化學(xué)鍵合相填料的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性有了較高的提高。

由于極性基團(tuán)的種類繁多，故可以通過改變極性基團(tuán)的方法控制分離的選擇性，因此具有更大的靈活性。極性鍵合相的極性通常弱于硅膠，所以更適于對中等極性物質(zhì)的分離，其色譜條件選擇的方便性和重復(fù)性均優(yōu)于硅膠。在極性鍵合相色譜填料中，研究較多的是氨基鍵合相填料。它的吸附過程與Si02相似但又有所不同。由于氨基的極性比硅羥基弱，且氨基位于烷基鏈末端，有一定的自由度(這與Si02及～20，不同)，加之氨基濃度亦較硅羥基濃度小，僅為2 mol/m2左右，故同一溶質(zhì)于相同條件下在氨基柱上的保留要小一些，在分離酸性化合物，如酚、羧酸、核苷酸時較為有用。此外，氨基鍵合相填料對某些物質(zhì)的特定基團(tuán)會表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性。例如，可以用乙腈一水為洗脫劑在氨基鍵合相柱子上分離單糖。氰基柱對幾何異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)目不同的化合物(環(huán)狀化合物)具有較好的分離能力。二醇基填料具有良好的生物相容性，更適于生化體系的分離。例如，多數(shù)以硅膠為基質(zhì)的凝膠過濾介質(zhì)，均采用了二醇基填料。硝基填料則對芳香族化合物有較好的選擇性。此外，短鏈配基的反相填料有時也可用作正相之用，例如，可用于油溶性維生素的分離分析，具有很好的重現(xiàn)性。1

常見的正相填料及色譜柱全多孔型的微球型或無定型硅膠，均可作為正相填料使用。但若用于高效分離，還是以球形硅膠為好，以其填裝的正相柱的滲透性較好，操作壓力較低，且柱子的穩(wěn)定性也比較好。4

影響正相色譜分離過程的參數(shù)比表面積和表面活性在正相色譜中，控制保留和選擇性的決定性參數(shù)是比表面積和表面活性，通過對這兩個參數(shù)的調(diào)節(jié)，可以調(diào)節(jié)一些分子的吸附一脫吸行為，從而達(dá)到分離的目的。對于硅膠，可以通過兩種方式降低其比表面積和表面活性。一種途徑是熱處理，當(dāng)溫度高于200℃時，其表面硅羥基會通過脫水而使表面活性降低；而在溫度高于600℃時，通過燒結(jié)可導(dǎo)致比表面積的減小。另一種途徑則是調(diào)整吸附劑的含水量，以改變其表面活性和有效比表面積。通常，比表面積為200～400m2/g、平均孔徑為6～10mm的多孔硅膠是最常用的正相色譜填料。

表面活性是正相色譜中作為填料的硅膠的另一個重要參數(shù)，它主要依賴于表面硅羥基的類型、分布及其反應(yīng)性。完全羥基化的表面具有最大的反應(yīng)性，表面吸附的水或其他極性化合物，即使是極少量也會明顯地降低表面活性。此外，比表面積相對較低的大孔硅膠，其表面硅羥基的分布一般較為均一。這是因為，在它們的制造過程中，通過熱處理或燒結(jié)已使其無定形表面部分地具有微晶形的特征。微孔硅膠的表面不確定性較高，故其表面活性比大孔硅膠要高。2

樣品在硅膠上的負(fù)載量及線性容量在所謂線性洗脫吸附色譜中，分離是在低樣品濃度下進(jìn)行的。此時，吸附等溫線是線性的。高樣品濃度將會導(dǎo)致吸附等溫線偏離線性，成為凸形或凹形吸附等溫線。填料的線性吸附容量，可以定義為在每克吸附劑上引起等溫線線性部分分配系數(shù)值產(chǎn)生相對10%變化時的樣品量。對于給定的溶質(zhì)和溶劑，線性容量主要決定于硅膠的比表面積及其表面活性。2

硅膠的吸附選擇性硅膠的吸附選擇性可以表現(xiàn)為多種形式，如分子量或分子尺寸選擇性、功能團(tuán)選擇性、形狀選擇性、異構(gòu)體選擇性以及生化選擇性等，LSC提供了對功能團(tuán)和異構(gòu)體選擇性分離的極好潛力。影響吸附劑選擇性的參數(shù)有：比表面積、平均孔徑和表面活性。2