[科普中國]-植物凝集素

定義

植物凝集素最早發(fā)現(xiàn)于1888年，Stillmark在蓖麻(Ricinus communis L．)籽萃取物中發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞凝集因子，它具有凝集紅細(xì)胞的作用。它是一類具有特異糖結(jié)合活性的蛋白，具有一個或多個可以與單糖或寡糖特異可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域。根據(jù)植物凝集素亞基的結(jié)構(gòu)特征，植物凝集素分成4種類型：部分凝集素、全凝集素、嵌合凝集素、超凝集素；根據(jù)氨基酸序列的同源性及其在進(jìn)化上的相互關(guān)系，植物凝集素分為7個家族：豆科凝集素、幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素、單子葉甘露糖結(jié)合凝集素、2型核糖體失活蛋白、木菠蘿素家族、葫蘆科韌皮部凝集素和莧科凝集素。

植物凝集素可識別并結(jié)合入侵者的糖結(jié)構(gòu)域，從而干擾該入侵者對植物產(chǎn)生的可能影響；植物凝集素的糖結(jié)合活性是針對外源寡糖，參與植物的防御反應(yīng)。許多植物凝集素可結(jié)合到諸如Glc、Man或Gal的單糖上，尤其對植物中不常見外來的寡糖具有更高的親和性。例如：結(jié)合幾丁質(zhì)植物凝集素識別真菌細(xì)胞壁及無脊椎動物的外骨骼成分中的碳水化合物。另外，許多凝集素在較高PH范圍內(nèi)穩(wěn)定、抗熱、抗動物及昆蟲蛋白酶等等。有些凝集素甚至是完全穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，如從刺茍麻莖中分離出的凝集素在三氯乙酸中保持穩(wěn)定，沸煮也不會失活。Peumans等(1998)認(rèn)為大多數(shù)植物凝集素存在于儲藏器官中，它們既可能作為一種氮源，也可以在植物受到危害作為一種防御蛋白發(fā)揮功能。因此植物凝集素是植物防御系統(tǒng)重要的組成部分，在植物保護(hù)上起著重要作用。筆者就植物凝集素在植物保護(hù)上的研究進(jìn)展作一綜述。1

分類豆科凝集素豆科凝集素特指一類在豆科植物中發(fā)現(xiàn)的植物凝集素(并不是所有來自豆科植物的凝集素都是豆科凝集素)，已發(fā)現(xiàn)存在于70多種植物中，是目前研究得最清楚的凝集素家族。大多數(shù)豆科凝集素存在于植物的成熟種子中，但在葉、莖和根等組織器官中也有發(fā)現(xiàn)，并且，一些豆科植物還具有多種凝集素。

豆科凝集素均由2～4個亞基組成，大多數(shù)亞基為250個氨基酸殘基構(gòu)成的分子量約為30 kDa的單鏈蛋白，部分亞基會在特定位點斷裂成2個多肽鏈，據(jù)此，又可將豆科凝集素分為單鏈豆科凝集素和雙鏈豆科凝集素。豆科凝集素是唯一一類具有特定二價金屬結(jié)合位點的凝集素，每個亞基都結(jié)合有一個Mn2+和一個Ca2+，它們對凝集素的糖結(jié)合活性發(fā)揮至關(guān)重要的作用，金屬離子并不直接與糖類相互作用，而是協(xié)助穩(wěn)定糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。并且，在所有豆科凝集素的亞基中，結(jié)合金屬離子的結(jié)構(gòu)域的纈氨酸和天冬氨酸的量是十分保守的。

幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素含有至少一個橡膠素結(jié)構(gòu)域，橡膠素是從巴西橡膠樹乳管細(xì)胞的黃色體中發(fā)現(xiàn)的分子量約為4.7 kDa的小分子酸性凝集素。

目前，已在蕁麻科、禾本科、罌粟科、商陸科和茄科中發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素。根據(jù)含有的橡膠素結(jié)構(gòu)域的個數(shù)，幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素又可分為只含有一個橡膠素結(jié)構(gòu)域的部分凝集素及常見的含有多個橡膠素結(jié)構(gòu)域的全凝集素，它們具有高度的序列同源性。

單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素是一個嚴(yán)格甘露糖結(jié)合特異性的凝集素超家族，目前已在蔥科、石蒜科、天南星科、鳳梨科、百合科和蘭科這六個單子葉植物家族中發(fā)現(xiàn)。構(gòu)成此家族凝集素的亞基有相似的序列和三級結(jié)構(gòu)，而凝集素本身的整體結(jié)構(gòu)由于亞基的大小差距甚大。根據(jù)亞基大小，這一家族的凝集素可分成2個亞族：由含有一個結(jié)構(gòu)域的分子量為11～14kDa的亞基組成的凝集素以及由具有2個結(jié)構(gòu)域的分子量約為30 kDa的亞基組成的凝集素．第二個亞族又可根據(jù)亞基2個結(jié)構(gòu)域的相似程度繼續(xù)細(xì)分為具有2個相同或高度相似結(jié)構(gòu)域和2個不同結(jié)構(gòu)域的凝集素。

木菠蘿相關(guān)凝集素木菠蘿素是從木菠蘿種子中分離得到的一種凝集素，具有半乳糖結(jié)合特異性。木菠蘿相關(guān)凝集素家族是與木菠蘿素的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系相近的一系列凝集素的統(tǒng)稱，這一家族的凝集素分為2個亞群：與木菠蘿素相似的具有GalNAc特異性的?？品N子凝集素。以及序列與?？品N子凝集素相似但糖結(jié)合特性相異的旋花科和菊科等凝集素，這一類凝集素具有甘露糖/麥芽糖結(jié)合特異性。

葫蘆科韌皮部凝集素葫蘆科韌皮部凝集素發(fā)現(xiàn)于葫蘆科植物的韌皮部，是由2個分子量約為25 kDa的非糖基化亞基組成的二聚體幾丁質(zhì)結(jié)合凝集素，可識別GlcNAc寡聚糖，并且寡聚糖對凝集素活力的抑制程度隨糖鏈延長而增強。目前還未有此家族凝集素的完整序列被準(zhǔn)確測定。

莧科凝集素莧科凝集素家族較小，只存在于一些莧科植物中，目前發(fā)現(xiàn)不超過10種，均具有GalNAc結(jié)合特異性，并且在氨基酸序列及三維結(jié)構(gòu)上與其他植物凝集素都存在差異。莧科凝集素都是由2個同源的亞基以頭一尾方式排列形成的二聚體。2

功能特性對植物病原菌的作用植物凝集素作為微生物與植物的共生介質(zhì)，可防止植物病原菌對植物的危害；Mishkid等(1982)研究發(fā)現(xiàn)，植物凝集素常積累于病原菌易侵染的部位，預(yù)示著凝集素可能參與對病原菌的防御。

對植物病原真菌的作用已有實驗證明，植物凝集素能結(jié)合真菌細(xì)胞、抑制孢子萌發(fā)和菌絲體生長。植物凝集素對真菌的抗生效應(yīng)可能與它特異結(jié)合暴露于真菌細(xì)胞壁表面的糖復(fù)合物并導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁及菌體結(jié)構(gòu)形態(tài)改變有關(guān)，凝集素可與真菌表面的葡聚糖、半乳糖、甘露糖等多糖結(jié)合，干擾真菌細(xì)胞壁的合成，影響其細(xì)胞的正常代謝。Peumans和Van Damme(1995)進(jìn)行的體外研究表明，麥胚凝集素(WGA)抑制綠色木霉的孢子萌發(fā)和菌絲生長，狹葉蕁麻凝集素抑制灰葡萄孢、鉤狀木霉和布拉克霉的生長。劉士莊等(1996)報道，棉花種子中凝集素含量與棉花抗枯萎病能力呈正相關(guān)，分離純化的棉花凝集素能明顯凝集枯萎病菌分生孢子，并抑制其萌發(fā)。曾日中等(1998)指出橡膠蛋白和其它植物凝集素一樣也具有抗真菌活性，可以抑制病原菌的侵染和生長，起到保護(hù)橡膠樹乳管的作用。余萍等(2004)研究發(fā)現(xiàn)狗脊蕨凝集素(w兒)對玉米大斑病菌有抑制作用。

對植物病原細(xì)菌的作用由于細(xì)菌細(xì)胞壁的作用，凝集素不能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)，因此不能改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或滲透細(xì)胞膜擾亂侵人微生物的正常細(xì)胞間進(jìn)程。植物凝集素是通過一種基于與細(xì)胞壁糖類，或細(xì)胞外聚糖相互作用的機制對細(xì)菌構(gòu)成抗生效應(yīng)。Sequeira(1977)等報道馬鈴薯凝集素能抗青枯假單胞菌；Broekaet (1986)等提出，刺蘋果種子凝集素可使幼根免受細(xì)菌侵染。Ayouba等(1994)研究指出，幾種豆科植物種子凝集素可與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚體(胞壁酸、N一乙酰胞壁酸、胞壁酰二肽等)發(fā)生強烈的相互作用。余萍等(2004)研究發(fā)現(xiàn)狗脊蕨凝集素 (wJL)對甘薯薯瘟病原細(xì)菌生長具有抑制作用。

對植物病毒的作用植物病毒不含聚糖，沒有凝集素的作用位點，因此植物凝集素對植物病毒無抑制作用。Peumans和Van Damme(1995)綜述道，一種稱為核糖體失活蛋白型的特殊類型凝集素對植物病毒具有抑制活性，其機理尚不清楚。但有殺蟲活性的凝集素可能會阻止或減少蟲傳播病毒病害的傳播。

對植物病原線蟲的作用這方面研究相對較少，僅常團(tuán)結(jié)等(2002)報道純化的雪花蓮?fù)庠茨?GNA)可以抗植物病原性線蟲。

對昆蟲的作用植物凝集素對昆蟲如同翅目昆蟲及動物產(chǎn)生毒害的機理還不清楚，一般認(rèn)為植物凝集素可能通過和糖蛋白，如和昆蟲圍食膜表面、消化道上皮細(xì)胞的糖綴合物、或糖基化的消化酶等結(jié)合，從而影響昆蟲、動物對營養(yǎng)吸收，促進(jìn)消化道中細(xì)菌的繁殖和誘發(fā)病灶，抑制昆蟲的生長發(fā)育和繁殖，最終達(dá)到殺蟲、或?qū)游锂a(chǎn)生毒害的作用。

菜豆凝集素(PHA)是第一個被描述的具有抗蟲性的植物凝集素。有趣的是，PHA對豆象幼蟲具有毒性的結(jié)論是基于一個錯誤的實驗結(jié)果，后來研究發(fā)現(xiàn)這種防衛(wèi)作用是由于含有A一淀粉酶抑制劑的緣故(Huesing等1991 。如今許多實驗表明，來源于麥胚、馬鈴薯塊莖、核桃、沙棘、水稻和刺蕁麻的凝集素對豌豆象甲幼蟲和豇豆象甲幼蟲的生長有抑制作用。WGA和紫色羊蹄甲種子凝集素在濃度很低時對歐洲玉米螟新生幼蟲就有致死作用；從雪花蓮和大蒜提取的凝集素對豇豆象鼻蟲和煙草天蛾幼蟲有毒性。雪花蓮凝集素(GNA)等對咀嚼式昆蟲和刺吸式昆蟲都有致死作用。黃大叻等 (1997)報道來源于掌葉半夏和半夏的凝集素對麥長管蚜、禾縊管蚜、棉蚜和桃蚜等有致死活性。王偉等(1998)獲得同時表達(dá)P—lec(豌豆外源凝集素基因)和CpT1(豇豆胰蛋白酶抑制劑)的雙價轉(zhuǎn)基因棉花，棉鈴蟲的存活率、平均體重、生物總量及蛻皮指數(shù)均明顯低于對照。毛雪等(1999)利用全純營養(yǎng)液飼養(yǎng)蚜蟲技術(shù)明確鑒定了棉花凝集素 (GHA)、蓖麻凝集素(ACA)、天南星凝集素(AMA)和伴刀豆凝集素(ConA)對棉蚜和麥長管蚜的抗生作用，盡管所測凝集素半致死濃度有差異。對于長角葉甲，Czapla實驗表明WGA、BPA可抑制40%

的蟲重，來源(EHL)凝集素在2%水平上致死率為100%，但由于EHL的熱不穩(wěn)定性，后來的實驗結(jié)果有些不一致；在0．1%水平上雪花蓮凝集素(GNA)、WGA對1齡、3齡灰、褐飛虱作用都非常明顯，同對照相比死亡率大于75%；WGA對黑尾葉蟬的致死率為l5%，GNA的致死率為87%；Powell等人以GNA、WGA 0．1%(w/v)人工飼料飼喂灰、褐飛虱，24h內(nèi)降低蜜汁分泌96%，而且GNA的抗性效果最佳；但豌豆凝集素對黑尾葉蟬成蟲則沒有效果；此外WGA、豌豆凝集素等5種凝集素也能減少馬鈴薯葉蟬成活時間。最近的工作發(fā)現(xiàn)刺吸式口器昆蟲如椰粉虱、葉蟬、蚜蟲等對一些單子葉植物甘露糖結(jié)凝集素敏感。劉紅霞等(2004)研究發(fā)現(xiàn)刺槐種子凝集素對舞毒蛾幼蟲的營養(yǎng)代謝有較強的抑制作用。

對高等動物捕食者的作用同昆蟲一樣，高等動物消化道上布滿了細(xì)胞膜糖蛋白及高度糖基化的粘蛋白，這就成了植物凝集素的無數(shù)作用位點，保護(hù)植物免受食草動物侵食。如動物食用植物血細(xì)胞凝集素(PHA)或生豆后會引起急性惡心伴有嘔吐和腹瀉，以至于動物寧肯挨餓也不食用含PHA飼料。3

應(yīng)用及前景在生物學(xué)研究方面的應(yīng)用植物凝集索由于專一的識別某一特定單糖或多糖中的特定糖基序列，不僅用于分離純化，也用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析。它們可識別糖鏈的不同類型、不同核心結(jié)構(gòu)，探測糖鏈分布，選用多種凝集索反復(fù)核對糖鏈的結(jié)構(gòu)可獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)論。利用凝集素親和層析。親和電泳和抗體凝集素酶免疫測定凝集素和糖鏈結(jié)合的強弱。細(xì)胞表面的糖鏈結(jié)構(gòu)因細(xì)胞種類、分化階段或功能狀態(tài)而異，因此可以利用凝集素分離無損傷，高存活率，高產(chǎn)量的特定結(jié)構(gòu)細(xì)胞亞群。在免疫學(xué)上植物凝集索還是不可缺少的促淋巴細(xì)胞有絲分裂劑。在神經(jīng)學(xué)科上，研究神經(jīng)元表面結(jié)構(gòu)，外周神經(jīng)元損傷帶來的后果及其修復(fù)機制，細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)受體等。

醫(yī)藥方面的應(yīng)用在某些惡性腫瘤中，某些蛋白如原發(fā)性肝癌中N一糖鏈發(fā)生變化，以此作為腫瘤診斷和鑒定。某些植物凝集素具有毒性，研究人員將完整的毒素分子或α鏈作為彈頭，利用化學(xué)偶聯(lián)劑與單克隆抗體制備成免疫毒素。免疫毒素可用于骨髓移植，體外清除其中的T細(xì)胞進(jìn)行異體移植，清除其中的癌細(xì)胞進(jìn)行自體移植，并防止減輕移植物抗宿主病。因此，在基因水平對小分子抗體和高活性的毒素彈頭相偶聯(lián)，將為腫瘤的導(dǎo)向治療提供新途徑。除抗體外，一些細(xì)胞因子和特定的糖鏈也可以作為導(dǎo)航裝置，也有將人絨毛促性腺β亞基和RTA相偶聯(lián)的報道。

在農(nóng)業(yè)抗蟲方面的應(yīng)用目前已經(jīng)克隆了一些對害蟲抗性較好的基因，并取得一些進(jìn)展。在植物中表達(dá)凝集素要求相對高的水平才具有較好的抗蟲效果，構(gòu)建強的高效表達(dá)載體，采用合適的強啟動子，針對害蟲取食是韌皮部都可采用特異性表達(dá)啟動子，或與其它的殺蟲蛋白相結(jié)合提高抗性。但植物凝集素對刺吸式害蟲的殺蟲性還不盡人意，有必要深入研究其作用機理，制定相應(yīng)策略提高抗蟲效果，著手新的抗蟲植物凝集素的克隆。與此同時，轉(zhuǎn)基因作物的安全有待進(jìn)一步證實。

糖工程是繼70年代基因工程，80年代蛋白質(zhì)工程之后的第三個前沿領(lǐng)域，植物凝集素在糖生物學(xué)研究中作為信息識別分子倍受矚目。隨著凝集素數(shù)據(jù)庫的建立，糖鏈結(jié)構(gòu)分析，糖鏈合成方法學(xué)，X-ray單晶衍射的發(fā)展，將有更多的凝集素的三維立體結(jié)構(gòu)，糖識別機制得以闡明。凝集素對糖識別機制的研究必將推動分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展。24

結(jié)語隨著人們長期單一地在作物中導(dǎo)人某個基因，如Bt基因，又出現(xiàn)了新的問題。一是應(yīng)用這類基因不能有效防治有些害蟲，如引起同翅目蚜蟲在轉(zhuǎn)Bt棉上的再猖獗現(xiàn)象；二是某些害蟲已對這類長期使用的基因產(chǎn)生了抗性，如鱗翅目的棉鈴蟲和小菜蛾已對Bt基因產(chǎn)生了不同程度的抗性。這種情況下，植物凝集素以其具有對鱗翅目、特別是對同翅目蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲及一些微生物有防效，對環(huán)境無污染，穩(wěn)定性好及對高等動物相對安全等優(yōu)點，為防治病蟲害開拓新思路。不可否認(rèn)，植物凝集素作為植物基因工程的一部分，將在培育抗病蟲品種、發(fā)展可持續(xù)農(nóng)業(yè)中大顯身手，植物凝集素更多的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲品種的培育，抗病品種篩選上還有待于突破。另一方面，植物凝集素對刺吸式害蟲的殺蟲性還不盡人意，如抗蟲性不強、抗蟲譜不廣等，因此有必要深入研究其作用機理，制定相應(yīng)策略提高抗蟲效果。

外源凝集素基因是一組廣泛存在于植物組織中的蛋白質(zhì)成分，在儲藏器官和繁殖器官中的含量尤其豐富。外源凝集素對植物有許多很重要的生理作用，其中在作物害蟲防治方面所能表現(xiàn)出的作用是保護(hù)功能，即在植物生長的各個階段，外源凝集素以不同的方式保護(hù)植物免受害蟲的侵害。研究結(jié)果表明，外源凝集素主要存在于植物細(xì)胞的蛋白粒中，一旦被害蟲攝食，外源凝集素便會在昆蟲的消化道內(nèi)釋放出來，并與腸道圍食膜上的糖蛋白相結(jié)合，影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收。同時，還可能在昆蟲的消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，促進(jìn)消化道內(nèi)細(xì)菌的增殖，對害蟲本身造成為害，從而達(dá)到殺蟲的目的。因而引起了人們對探討外源凝集素基因在抗蟲植物基因工程中應(yīng)用的極大興趣。人們已分離出多種外源凝集素基因，然而由于多種外源凝集素對人和哺乳動物有較強的毒副作用，因而在生產(chǎn)上應(yīng)用較少。但也有一些特例，其中豌豆外源凝集素和雪蓮花外源凝素（GNA）對人的毒性極低，但對害蟲卻有極強的抑制作用，因而倍受人們的重視?，F(xiàn)已證明GNA對稻褐飛虱、黑尾葉蟬有極強的毒殺作用，同時還能抑制蚜蟲的生長。因而通過植物基因工程技術(shù)將GNA基因?qū)氲街参矬w內(nèi)，以培育出對稻褐飛虱、蚜蟲等刺吸式害蟲有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。到目前為止，已有至少10種植物獲得了轉(zhuǎn)GNA基因抗蟲植株，它們分別是油菜、西紅柿、水稻、甘蔗、甘薯、向日葵、煙草、馬鈴薯、大豆和葡萄等，均表現(xiàn)出一定的抗蟲性。56