[科普中國]-食品中葉酸的測(cè)定

前言

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 5009.211-2008《食品中葉酸的測(cè)定》1。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 5009.211-2008相比，主要變化如下:

—標(biāo)準(zhǔn)名稱修改為“食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中葉酸的測(cè)定”;

—修改了菌種名稱，由干酪乳桿菌改為鼠李糖乳桿菌;

—?jiǎng)h除了培養(yǎng)基和用于葉酸鹽降解的雞胰腺供貨信息;

—?jiǎng)h除了附錄B中酶解酪蛋白液的制備方法;

—增加了檢出限和定量限。

范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中葉酸的測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中葉酸的測(cè)定。

原理葉酸是鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp. rhamnosus(ATCC 7169)生長所必需的營養(yǎng)素，在定控制條件下，將鼠李糖乳桿菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)一段時(shí)間后測(cè)定透光率(或吸度值)，根據(jù)葉酸含量與透光率(或吸光度值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出試樣中葉酸的含量。

試劑和材料注：除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級(jí)水。

試劑鹽酸(HCl)

氫氧化鈉(NaOH)

氯化鈉(NaCI)

十二水合磷酸鈉(Na3HPO4·12H2O)

七水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·7H2 O)

磷酸氫二鉀(K2 HPO4 )

三水合磷酸二氫鉀(KH2PO4·3H2O)

七水合硫酸鎂(MgSO4·7H2 O)

七水合硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)

一水合硫酸錳(MnSO4·H2O)

三水合乙酸鈉(CH3CooNa·3H2O)

葡萄糖(C6H12 O6)

抗壞血酸(C6H8O6)

甲苯(C7H8)

無水乙醇(C2H6O)

雞胰腺干粉：含γ~谷胺酸基水解酶

木瓜蛋白酶：酶活力≥5 U/mg

a一淀粉酶：酶活力≥1.5 U/mg

蛋白陳：含氮量≥10%

酵母提取物(干粉)：含氮量≥10%

瓊脂。

試劑配制磷酸緩沖液(0.05 mol/L, pH6.8)：分別稱取4.35 g十二水合磷酸鈉和10.39 g七水合磷酸氫二鈉，用水溶解并稀釋至1L，混勻。加入2 mL甲苯，室溫保存。臨用前按大約5 mg/mL的比例加入抗壞血酸作為葉酸保護(hù)劑，加入量以pH達(dá)到6.8為宜。

乙醇溶液(20%，體積分?jǐn)?shù))：量取200 mL無水乙醇與800 mL水混勻。

氫氧化鈉乙醇溶液(0.01 mol/L)：稱取0.1 g氫氧化鈉，用乙醇溶液溶解并稀釋至1L,混勻。

氫氧化鈉溶液((1 mol/L):稱?。?0 g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至1L,混勻。

鹽酸溶液((1 mol/L)：量取83.3 mL鹽酸，用水稀釋至1L_,混勻。

鹽酸浸泡液：量取100 mL鹽酸與50倍水混合。

雞胰腺溶液：稱取100 mg雞胰腺干粉，加入20 mL磷酸緩沖液，搖勻。現(xiàn)用現(xiàn)配。

蛋白酶一淀粉酶液：分別稱取200 mg木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，加入20 mL磷酸緩沖液研磨至勻漿，3 000 r/min離心5 min?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

培養(yǎng)基甲鹽溶液：分別稱取25 g磷酸氫二鉀和25 g三水合磷酸二氫鉀，加水溶解并稀釋至500 mL,混勻。加入1 mL甲苯，2 ℃~4℃冰箱可保存1年。

乙鹽溶液：分別稱取10 g七水合硫酸鎂、0.5 g氯化鈉,0.5 g七水合硫酸亞鐵和0. 5 g一水合硫酸錳，加水溶解并稀釋至500 mL。加5滴鹽酸，于2℃~4℃冰箱可保存1年。

瓊脂培養(yǎng)基：按表1稱量或吸取各試劑，加水至100 mL,混合，沸水浴加熱至瓊脂完全溶化。趁熱用1 mol/L鹽酸溶液和1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8士0.1。盡快分裝，根據(jù)試管內(nèi)徑粗細(xì)加入3 mL~5 mL，液面高度不得低于2 cm。塞上棉塞，121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)高壓滅菌15 min。試管取出后直立放置，待冷卻后于冰箱內(nèi)保存，備用。

葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液：可按附錄A配制葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液，也可直接由試劑公司購買效力相當(dāng)?shù)娜~酸測(cè)定用培養(yǎng)基，用前按說明書配制。

標(biāo)準(zhǔn)品葉酸標(biāo)準(zhǔn)品(C19 H19 N7 O6 )：純度≥99%。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20.0μg/mL)：精確稱取20.0 mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用氫氧化鈉乙醇溶液溶解并轉(zhuǎn)

移至1 000 m工矛容量瓶中，定容至刻度。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度標(biāo)定：準(zhǔn)確吸取1.0 m工矛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至5 mL矛容量瓶中，用氫氧化鈉溶液定容至刻度。用紫外一可見分光光度計(jì)，于比色杯厚度1 cm，波長256 nm條件下，以氫氧化鈉乙醇溶液調(diào)零點(diǎn)，測(cè)定3次標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值，取平均值按式(1)計(jì)算葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度。

.............(1)

式中:

c1—標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中葉酸濃度，單位為微克每毫升(mg/mL) ;

A—平均吸光度值;

E—摩爾消光系數(shù)，數(shù)值為21 500;

M—葉酸相對(duì)分子質(zhì)量，數(shù)值為441.12;

5—稀釋倍數(shù);

1 000—由克每升換算為微克每毫升的換算系數(shù)。

標(biāo)定好的葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液儲(chǔ)存于棕色瓶中，于2 ℃~4℃冰箱可保存兩年。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液(0.200μg/mL)：準(zhǔn)確吸取1.00 mL矛葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置于100 mL棕色容量瓶中，用氫氧化鈉乙醇溶液稀釋并定容至刻度，混勻后儲(chǔ)存于瓶中2℃~4℃冰箱可保存1年。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液(0.200 ng/mL)：準(zhǔn)確吸取1.00 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)中間液置于1 000 mL容量瓶中，用水稀釋定容至刻度，混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

儀器和設(shè)備天平:感量為0.1 mg和1 mg

恒溫培養(yǎng)箱：37℃士1℃

壓力蒸汽消毒器：121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)

渦旋振蕩器

離心機(jī):轉(zhuǎn)速)3 000 r/min

接種環(huán)

pH計(jì)：精度為士0.1

紫外-可見分光光度計(jì)

超凈工作臺(tái)

超聲波振蕩器

菌種的制備與保存菌種鼠李糖乳桿菌Lactobacillus casei spp. rhamnosus(ATCC 7169)

儲(chǔ)備菌種的制備將菌種鼠李糖乳桿菌轉(zhuǎn)接至瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃士1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h~21 h，連續(xù)傳種2代一3代。取出后放入2 ℃~4℃冰箱作為儲(chǔ)備菌株保存。每月至少傳代1次，可傳30代。

實(shí)驗(yàn)前將儲(chǔ)備菌株接種至瓊脂培養(yǎng)基中，在37℃士1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h~ 21 h以活化菌株，用于接種液的制備。

注：保存數(shù)周以上的儲(chǔ)備菌種，不能立即用作接種液制備，實(shí)驗(yàn)前宜連續(xù)傳種2代一3代以保證細(xì)菌活力。

接種液的制備試驗(yàn)前一天，取2mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液與4mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液混勻，分裝至2支5mL離心管中，塞上棉塞，于121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)高壓滅菌15 min后即為種子培養(yǎng)液。冷卻后用接種環(huán)將活化的菌株轉(zhuǎn)種至2支種子培養(yǎng)液中，于37℃士1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h～21 h。取出后將種子培養(yǎng)液混懸，無菌操作下用無菌注射器吸取0. 5 mL轉(zhuǎn)種至另兩支已消毒但不含葉酸的培養(yǎng)液中，于37℃士1℃再培養(yǎng)6h。振蕩混勻，制成接種液，立即使用。

分析步驟(所有操作均需避光進(jìn)行)試樣制備谷薯類、豆類、乳粉等試樣需粉碎、研磨、過篩(篩板孔徑0.3 mm~0.5 mm)；肉、蛋、堅(jiān)果等用勻質(zhì)器制成食糜；果蔬、半固體食品等試樣需勻漿混勻；液體試樣用前振搖混合。于1℃冰箱可保存1周。

試樣提取直接提取法

形態(tài)為顆粒、粉末、片劑、液體的營養(yǎng)素補(bǔ)充劑或強(qiáng)化劑、預(yù)混料；以飲料為基質(zhì)或葉酸添加量>100 μg/100 g的食品可采用直接提取法。

準(zhǔn)確稱取固體試樣0.1 g~0.5 g或液體試樣0. 5 g~2 g，精確至0.001 g，轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶中，加入80 mL氫氧化鈉乙醇溶液，具塞，超聲振蕩2 h~1 h至試樣完全溶解或分散，用水定容至刻度。

酶解提取法

谷薯類、肉蛋乳類、果蔬菌藻類、豆及堅(jiān)果類等食品試樣宜采用酶解提取法。

準(zhǔn)確稱取適量試樣(約含0.2μg~2μg葉酸)，精確至0.001 g。一般谷薯類、肉類、乳類、新鮮果蔬、菌藻類試樣2g~5g；蛋類、豆、堅(jiān)果類、內(nèi)臟、干制試樣0.2 g~2 g;流質(zhì)或半流質(zhì)試樣5 g~10 g。轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶中，加30 mL磷酸緩沖液，振搖5 min后，具塞，于121 ℃ (0.10 MPa~0.12 MPa)高壓水解15 min。

試樣取出后冷卻至室溫，加入1 mL雞胰腺溶液;含有蛋白質(zhì)、淀粉的試樣需另加入1 mL蛋白酶-淀粉酶液，混合。加入3滴一5滴甲苯后，置于37℃士1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)酶解16 h~20 h。取出，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，加水定容至刻度，過濾。 另取一只錐形瓶，同試樣操作，定容至100 mL，過濾。作為酶空白液。

注：以谷物、乳粉等為基質(zhì)的配方食品如需計(jì)量基質(zhì)本底葉酸含量，可采用酶解法提取。

稀釋根據(jù)試樣中葉酸含量用水對(duì)試樣提取液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使試樣稀釋液中葉酸含量在0.2 ng/mL~0.6ng/mL范圍內(nèi)。

測(cè)定系列管制備所用試管使用前洗刷干凈，沸水浴30 min，瀝干后放入鹽酸浸泡液中浸泡2h，經(jīng)170℃±2 0C烘干3h后使用。

試樣和酶空白系列管

取3支試管，分別加入0.5 mL、1.0 mL、 2.0 mL試樣稀釋液(V)，補(bǔ)水至5.0 mL。加入5.0 mL葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液，混勻。另取3支試管同法加入酶空白液。

標(biāo)準(zhǔn)系列管

取試管分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.00 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、

2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL和5.00 mL，補(bǔ)水至5.00 mL，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量為0.00 ng、0.05 ng、 0.10 ng、0.20 ng、0.30 ng、0.10 ng、0.50 ng、0.60 ng、0.80 ng、1.00 ng，再加入5.0 m L葉酸測(cè)定用培養(yǎng)液，混勻。為保證標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系，應(yīng)制備2套一3套標(biāo)準(zhǔn)系列管，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)平均值計(jì)算。

滅菌將所有測(cè)定系列管塞好棉塞，于121 ℃ (0.10 MPa～0.12 MPa)高壓滅菌15 min。

接種和培養(yǎng)待測(cè)定系列管冷卻至室溫后，在無菌操作條件下，用預(yù)先高壓滅菌的移液管向每支測(cè)定管加接種液20μL，混勻。塞好棉塞，置于37℃士1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h～10 h，直至獲得最大混濁度，即再培養(yǎng)2h透光率(或吸光度值)無明顯變化。另準(zhǔn)備一支標(biāo)準(zhǔn)0管(含0.00 ng葉酸)不接種作為0對(duì)照管。

測(cè)定將培養(yǎng)好的標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣和酶空白系列管用漩渦混勻器混勻。用厚度為1 cm比色杯，于510 nm處，以未接種0對(duì)照管調(diào)節(jié)透光率為100%(或吸光度值為0)，依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列管、試樣和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0對(duì)照管有明顯的細(xì)菌增長;或與0對(duì)照管相比，標(biāo)準(zhǔn)0管透光率在90%以下(或吸光度值在0.1以上)，或標(biāo)準(zhǔn)系列管透光率最大變化量