[科普中國]-二次諧波

諧波產(chǎn)生的根本原因是由于非線性負(fù)載所致。當(dāng)電流流經(jīng)負(fù)載時，與所加的電壓不呈線性關(guān)系，就形成非正弦電流，從而產(chǎn)生諧波。諧波頻率是基波頻率的整倍數(shù)，根據(jù)法國數(shù)學(xué)家傅立葉(M．Fourier)分析原理證明，任何重復(fù)的波形都可以分解為含有基波頻率和一系列為基波倍數(shù)的諧波的正弦波分量。諧波是正弦波，每個諧波都具有不同的頻率，幅度與相角。諧波可以I區(qū)分為偶次與奇次性，第3、5、7次編號的為奇次諧波，而2、1 4，6、8等為偶次諧波，如基波為50Hz時，二次諧波為lOOHz，三次諧波則是150Hz。

二次諧波顯微成像技術(shù)微觀世界的很多有用信息可以通過采用顯微技術(shù)獲得，顯微成像技術(shù)在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)測量等不同領(lǐng)域有著巨大的研究價值和廣泛的應(yīng)用，因此，顯微成像技術(shù)一直是人們研究的熱點。非光學(xué)顯微術(shù)，如電子顯微技術(shù)、掃描隧道顯微技術(shù)等，存在對觀察樣品環(huán)境要求嚴(yán)格、對觀察對象造成傷害、對觀察樣品限制較多等弱點，而光學(xué)顯微術(shù)沒有這些弱點缺陷，因此，光學(xué)顯微術(shù)的發(fā)展完善和功能拓展具有重要意義。近年來，計算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)和精密機(jī)械電子等技術(shù)得到飛速發(fā)展，隨著這些技術(shù)的提高，出現(xiàn)了激光共焦掃描顯微成像技術(shù)、雙光子激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)、光學(xué)相干層析成像等很多種不同功能和特性的現(xiàn)代光學(xué)顯微術(shù)。二次諧波顯微成像技術(shù)是其中的一種現(xiàn)代非線性光學(xué)顯微術(shù)，它利用光與物質(zhì)相互作用時產(chǎn)生的二次諧波信號進(jìn)行顯微成像或探測。

二次諧波顯微成像原理在非線性光學(xué)過程中，在強(qiáng)激光作用下的非線性介質(zhì)，其電極化強(qiáng)度與激發(fā)光場的關(guān)系可以表示為 ：

量公式（1）說明極化強(qiáng)度是由激發(fā)光場和介質(zhì)相互作用而產(chǎn)生的，它不僅與入射到介質(zhì)中的激發(fā)光場的光場強(qiáng)度有關(guān)，還與介質(zhì)的極化率有關(guān)。在非線性光學(xué)中，這些線性和非線性極化率與介質(zhì)的微觀特性有關(guān)，代表了介質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)，反映了介質(zhì)的電子態(tài)、分子的對稱性、旋向及排列等，因此介質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)信息可以通過探測介質(zhì)非線性光學(xué)現(xiàn)象來獲得。二次諧波產(chǎn)生過程是和頻過程的一種特殊情況，即倍頻。倍頻效應(yīng)是指兩個頻率相同的入射光發(fā)生和頻作用，其輸出光波的頻率為入射光場頻率的二倍，其中入射光波稱為基頻，輸出倍頻光波稱為二次諧波。相應(yīng)的極化強(qiáng)度為：

二次諧波產(chǎn)生需要滿足兩個條件：一是要求介質(zhì)要具有非中心對稱性。在電偶極子近似下，具有中心對稱性的介質(zhì)，其二階電極化率張量為零，則不能產(chǎn)生二次諧波信號。二是要求滿足相位匹配條件。相位匹配直接決定一個非線性光學(xué)過程的效率。如果二次諧波產(chǎn)生過程中完全滿足相位匹配條件，則傳播中的倍頻光波和不斷產(chǎn)生的倍頻極化波之間保持相位的一致性，相互干涉，產(chǎn)生的二次諧波強(qiáng)度由零開始逐漸增大，直至基頻波的功率完全轉(zhuǎn)為二次諧波的功率，獲得最大的二次諧波輸出功率。

二次諧波顯微成像裝置由四個部分組成：第一部分是光源，通常需要提供功率適中的激發(fā)光，既可以保證產(chǎn)生較強(qiáng)的二次諧波信號，也可以避免樣品受損。在二次諧波顯微技術(shù)中光源通常采用可在整個紅外區(qū)內(nèi)可調(diào)諧的摻鈦藍(lán)寶石飛秒激光器。第二部分是物鏡，可以減小激發(fā)光的激發(fā)區(qū)域，并收集樣品產(chǎn)生的非軸向輻射的二次諧波信號，避免能量損失。通常采用數(shù)值孔徑足夠大的物鏡。第三部分是濾光片組，可保證收集到的信號為二次諧波信號，過濾干擾信號。在前向探測模式中，通常采用短通濾光片和窄帶濾光片，在背向探測模式中，通常采用窄帶濾光片。第四部分為信號探測系統(tǒng)，可以進(jìn)行二次諧波信號的收集探測。通常采用高靈敏度的PM T探測器，或與激發(fā)光源同步的信噪比高的鎖相放大器。

二次諧波顯微成像技術(shù)特點不同于其他的現(xiàn)代光學(xué)顯微成像技術(shù)，二次諧波顯微成像技術(shù)由于利于樣品的非線性特性產(chǎn)生的二次諧波信號進(jìn)行成像和探測，因此，具有以下主要特點：

①傳統(tǒng)的激光共焦顯微鏡采用共焦小孔成像，二次諧波顯微成像產(chǎn)生的信號光由于非線性效應(yīng)的強(qiáng)局域特性被局限在焦點附近很小的區(qū)域里，在成像過程中非焦點區(qū)域發(fā)光對測量結(jié)果的影響大大減小，因此，它不采用共焦小孔就可以實現(xiàn)高分辨率成像，還具有較高的信噪比，具有較高的三維空間分辨率，并且可以對具有一定厚度的樣品進(jìn)行層析成像。

②在二次諧波顯微成像技術(shù)中，通常激發(fā)光源采用近紅外的飛秒激光器，這樣減小了對生物樣品的光損傷，降低了光漂泊，增加了樣品的穿透深度。

③二次諧波信號是樣品的原發(fā)性信號，成像過程不需要使用染料進(jìn)行染色，這樣避免了光化學(xué)毒性及染色過程中的物理損傷，沒有染色過程也使該技術(shù)可用于很多被測樣品不能進(jìn)行熒光標(biāo)記的成像探測。

④利用二次諧波信號進(jìn)行成像或探測時，二次諧波信號的相干性使其對樣品局部微觀結(jié)構(gòu)具有較高的敏感性，因此探測到的二次諧波信號不僅能反映與樣品有關(guān)的強(qiáng)度信息，還可以反映樣品的分子取向、排列方式等局部微觀結(jié)構(gòu)，這些重要而本質(zhì)的信息可以通過分析信號的角度分布或偏振特性等得到。

⑤二次諧波顯微鏡雖未商品化，但雙光子熒光顯微系統(tǒng)已經(jīng)商品化，二次諧波成像顯微鏡可以很容易地在其基礎(chǔ)上經(jīng)過簡單改造獲得，如通過更換濾光片改造而成，耗費(fèi)較小。

⑥二次諧波成像顯微鏡可以收集背向信號，可以和其他的成像技術(shù)進(jìn)行同時探測，如雙光子熒光顯微鏡、光學(xué)相干層析成像，實現(xiàn)多通道顯微成像或探測，更加有利于進(jìn)行成像結(jié)果對比研究，實現(xiàn)信號互補(bǔ)。

二次諧波顯微成像技術(shù)的應(yīng)用在生命科學(xué)領(lǐng)域，二次諧波顯微成像技術(shù)由于其無光損傷、無光毒性、無光漂白等特點，在生物組織成像中有廣泛的應(yīng)用。研究表明，一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白、肌動球蛋白復(fù)合、微管蛋白等，都具有很強(qiáng)的二次諧波信號，不同的膠原蛋白類型在同等激發(fā)條件下，呈現(xiàn)不同的二次諧波信號強(qiáng)度，因此二次諧波顯微成像技術(shù)可以用于生物組織的結(jié)構(gòu)蛋白成像。生物細(xì)胞和組織成像也可以通過二次諧波顯微成像技術(shù)實現(xiàn)，Shi-W eiChu等人曾用此技術(shù)觀察到了斑馬魚體內(nèi)細(xì)胞分芽繁殖、原腸胚的形成、組織的形成等晶胚發(fā)育過程 。Andrew等人用苯乙烯基染劑產(chǎn)生二次諧波 信 號 ，研 究 發(fā) 現(xiàn) 其 對 膜 電 壓 的 敏 感 度 達(dá) 到40/100m V。二次諧波成像可以實現(xiàn)膜之間分離距離的測量，測量的精度比其他顯微鏡都高。不僅如此，根據(jù)二次諧波信號對分子分布的對稱性的依賴，可以實時觀察膜上分子的動力學(xué)變化規(guī)律，這比通常使用的核磁共振更加方便快捷。因此二次諧波顯微技術(shù)在膜成像和動態(tài)測量中有重要的應(yīng)用 。另外，二次諧波顯微成像可以對基因組DNA溶液、細(xì)胞核提取物、培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核等不同DNA樣品進(jìn)行檢測，獲取DNA樣品的二次諧波信號并進(jìn)行高解析度成像 。

在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，二次諧波顯微成像技術(shù)在腫瘤、皮膚科、牙科等研究方向都有廣泛的應(yīng)用。二次諧波顯微成像技術(shù)能探測到子宮頸、口腔、食道、耳朵、鼻子等處的粘膜組織的病變，為腫瘤的診斷和分析提供了一份很好的參考，在癌癥的早期診斷中能起到一定的作用。另外，通過二次諧波顯微成像可以實現(xiàn)藥物通透性的活體監(jiān)控。二次諧波顯微成像技術(shù)可以實現(xiàn)牙齒的成像，為牙科提供了一種新的光學(xué)診斷方法。此外，該技術(shù)還可以在不損傷角膜的情況下觀察到角膜的結(jié)構(gòu)，以及實現(xiàn)對眼底視網(wǎng)膜的成像研究。

在材料科學(xué)領(lǐng)域，二次諧波顯微成像技術(shù)在納米材料方向中也有廣泛的應(yīng)用。二次諧波顯微成像技術(shù)可以對單個有機(jī)納米晶體的取向進(jìn)行探測，從而判斷納米晶體的晶體類型，也可以通過分析二次諧波信號的偏振特性來分析氧化鋅薄膜的結(jié)晶品質(zhì)和晶體生長取向，還可以通過偏振分析和離焦成像的方法獲得單個KTP納米粒子的三維取向信息和晶軸的歐拉角 。對于中心對稱材料，其表面由于對稱性遭到破壞而可以產(chǎn)生表面二次諧波信號，不僅能反映各向同性媒質(zhì)屬性，還可以反映長程有序材料的晶體結(jié)構(gòu)。1

二次諧波成像技術(shù)在生物組織的應(yīng)用進(jìn)展二次諧波成像二次諧波（SHG）是二階非線性過程，它是基于雙光子激發(fā)熒光顯微鏡之上； 雙光子激發(fā)熒光顯微鏡不需要共焦針孔就可以實現(xiàn)三維高分辨率，并且其激發(fā)的激光在組織中的穿透深度大，因此成像深度比較大。針對生物組織，二次諧波信號成像還具有如下特點，如：

①二次諧波是生物組織原發(fā)性信號，從而光致毒性、光損傷和光漂

白這些致缺點對其而言就不復(fù)存在了。

②SHG 是相干散射過程，所成的像能反映出樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

③二次諧波的光譜寬度完全由激發(fā)光源決定，此點很重要，因為各

種信號干擾就會被有效消除了，從而獲得較高的圖像分辨率。

④在無外加染料的情況下，生物組織的成像依舊完好。

SHG 成像在生物組織的應(yīng)用現(xiàn)狀Denk 與 Webb 等人于 1990 年首次展示雙光子激發(fā)熒光顯微成像，之后雙光子顯微鏡 (Two-photon Microscopy) 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，是研究光與組織間的物理和生物效應(yīng)、細(xì)胞之間的相互作用、細(xì)胞內(nèi)生化成分和離子濃度的變化等的有力工具。

1998年，Peter T. C. So 及其研究成員 對穿孔的鼠耳進(jìn)行雙光子深度分辨成像，并進(jìn)行 3D 圖像重構(gòu)，獲得了的皮膚結(jié)構(gòu)符合組織病理學(xué)已有的結(jié)論，即角質(zhì)細(xì)胞在上皮層，膠原和彈力纖維在真皮層，軟骨在皮下的皮膚結(jié)構(gòu)。

2001年，F(xiàn)ernando A. Navarro 研究小組 利用雙光子共聚焦顯微鏡觀察幾內(nèi)亞小豬皮膚創(chuàng)傷修復(fù)情況，并與傳統(tǒng)的使用蘇木精和伊紅染色劑的二維顯微圖像比較發(fā)現(xiàn)，雙光子共聚焦顯微鏡能夠得到三維重構(gòu)圖像。 實驗還使用化學(xué)試劑或膠帶剝離角質(zhì)層后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)雙光子共聚焦顯微鏡圖像能達(dá)到更深的基細(xì)胞層， 真皮與上皮交界層，清楚地分辨角質(zhì)細(xì)胞，基細(xì)胞和膠原纖維。 對傷口修復(fù)的研究表明，創(chuàng)傷時角質(zhì)層通常是不存在的，因此移除是沒有必要的。

2002年，Steven R. Beanes 等人 運(yùn)用共聚焦顯微鏡觀測不同孕育期的胎鼠創(chuàng)傷，實驗發(fā)現(xiàn)：胎鼠傷口在孕育期從無疤痕到有疤痕修復(fù)的轉(zhuǎn)變主要受創(chuàng)傷的大小和胎兒孕育時間的影響。 該實驗小組早期主要是利用組織液培育切割的離體的母鼠創(chuàng)傷模型。 該模型在仿真?zhèn)谛迯?fù)中有明顯的缺陷，即不能完整修復(fù)真皮缺損，僅僅是表皮再生，部分真皮修復(fù)發(fā)生。 而且血液產(chǎn)生的因子，比如細(xì)胞活素，激素，血小板對傷口修復(fù)的影響將無法分析。 至此，沒有離體皮膚傷口修復(fù)的模型能完整模擬真皮的修復(fù)。

2005年，R.Cicchi 等人 研究發(fā)現(xiàn)利用光透明劑對組織的不同成分的影響程度不同和光透明劑滲透進(jìn)組織后會導(dǎo)致組織的局部脫水，就可以增強(qiáng)光在組織中不同成分間分布的差別，從而提高二次諧波成像的成像對比度。 得出了光透明劑在提高生物組織雙光子熒光顯微成像深度的同時也提高了成像對比度的研究結(jié)論。

2007年，Iris Riemann 等人 [6] 通過基于飛秒激光近紅外脈沖的多光子層析成象系統(tǒng) DermaInspect 觀察除痣后人體真皮創(chuàng)傷的愈合和疤痕的形成。 通過內(nèi)源熒光團(tuán)的自體熒光和膠原的二次諧波 (SHG) 能觀測修復(fù)過程中主要膠原纖維的聚合。 實驗發(fā)現(xiàn)修復(fù)過程中深層的乳頭狀層和基層似乎向上移動， 14 — 15 天乳頭狀層中的出現(xiàn)纖維， 28~35 天纖維量達(dá)到最大。 同時還發(fā)現(xiàn)垂直傷口閉合方向出現(xiàn)大量膠原纖維結(jié)構(gòu)。 實驗表明 DermaInspect 系統(tǒng)能夠觀察創(chuàng)傷愈合不同時期細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)的自體熒光和膠原纖維沉積，將成為皮膚科醫(yī)生診斷和檢測治療效果有利的工具。

2008年，Jason N.Rogart 等利用多光子顯微鏡來決定激發(fā)胃腸黏膜的最佳激發(fā)波長，得到用 735nm 激發(fā)，能夠出現(xiàn)多光子自體熒光強(qiáng)度峰值；而且與共聚焦顯微相比，多光子顯微檢測得到的細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)更加清晰，像上皮細(xì)胞核、杯狀細(xì)胞、異色纖維和細(xì)胞等結(jié)構(gòu)的分辨率相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)的 H&E 染色組織學(xué)結(jié)構(gòu)。該研究顯示，多光子顯微鏡可以在細(xì)胞水平上檢測腸胃黏膜組織， 且不需要任何熒光染料，為活檢技術(shù)提供大量實用的參考依據(jù)。

2010年，Hongchun Bao 等人 利用緊式顯微內(nèi)鏡，獲取體內(nèi)的二次詣波成像，從而達(dá)到實時監(jiān)控體現(xiàn)膠原的含量和結(jié)構(gòu)的目的。 膠原變化對于不同疾病的早期診斷具有很重要的意義。 本研究首次通過光纖維將非線性顯微內(nèi)鏡應(yīng)用于二次詣波成像。 高分辨的二次詣波成像可揭示出蛋白和膠原的結(jié)構(gòu)，并確定結(jié)構(gòu)的方向和維度。

2011年，Naoyuki Morishige 等人 通過二次諧波獲得膠原片層的三維結(jié)構(gòu)，而人眼角膜前基質(zhì)的膠原片層的結(jié)構(gòu)是角膜硬度的決定因素，此對眼疾的診斷和治療有著重要的意義。

存在的問題及展望基于二次諧波信號成像的非線性光學(xué)成像技術(shù) , 能夠為生物組織的早期無損診斷提供有效的方法 , 然而由于組織的渾濁特性使其對可見光和近紅外波長具有很強(qiáng)的散射效應(yīng) , 導(dǎo)致基于激光的治療和診斷技術(shù)受到很大限制。 使用光透明劑 ( 甘油等 ) 提高組織內(nèi)部的折射率匹配從而降低散射效應(yīng)的方法能夠非常有效地提高生物組織二次諧波成像深度和對比度 , 有望在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。2

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

張磊 - 副教授 - 西南大學(xué)