[科普中國]-心臟停搏

由于心臟竇房結(jié)不能產(chǎn)生沖動，使心房或整個心臟停止活動，心電圖表現(xiàn)為一段較長時間內(nèi)無P波及QRS波，其長間期與正常竇性的PP間期之間無倍數(shù)關(guān)系，長間期后可見交界區(qū)或室性逸搏性心律簡介

目的探討匹那地爾對高鉀停搏液處理后大鼠離體心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣與舒縮功能的影響。方法SD大鼠心室肌細(xì)胞酶解分離靜息1～2h后隨機分為對照組，高鉀停搏液組，匹那地爾強化組，格列苯脲拮抗組。四組細(xì)胞均在24℃下保存2h,此后對細(xì)胞進(jìn)行復(fù)氧、復(fù)灌20min并測定細(xì)胞收縮、［Ca2+］i瞬態(tài)、肌漿網(wǎng)內(nèi)貯鈣釋放功能。結(jié)果匹那地爾使心肌細(xì)胞在缺血再灌注中收縮功能，［Ca2+］i瞬態(tài)，肌漿網(wǎng)內(nèi)貯鈣釋放能力明顯優(yōu)于高鉀停搏液組（P＜0.01〉及細(xì)胞內(nèi)鈣釋放后的鈣峰回落時間明顯短于高鉀停搏液組（P＜0.01〉。結(jié)論匹那地爾通過維持良好的肌漿網(wǎng)和細(xì)胞膜Na+/Ca2+交換體功能來調(diào)節(jié)鈣瞬態(tài)變化，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載從而改善心肌細(xì)胞缺血后收縮功能，同時避免了高鉀停搏液的負(fù)面效應(yīng)。

關(guān)鍵詞心臟停搏液；心肌細(xì)胞；大鼠

雖然高鉀停搏液能起到較好的心肌保護作用，但仍有證據(jù)表明暴露在這種溶液后的心肌功能有一定程度的損害，如心肌收縮力下降，細(xì)胞內(nèi)鈣超載［1］，可能與肌漿網(wǎng)鈣釋放及Na+/Ca2+交換體的鈣外排減少有關(guān)［2］。激活A(yù)TP敏感鉀通道（KATP）可減少L-型鈣通道的鈣內(nèi)流，促進(jìn)Na+/Ca2+交換體的鈣外排，使細(xì)胞免于損傷和頓抑［3，4］。本研究目的在于用單細(xì)胞收縮、細(xì)胞內(nèi)鈣［Ca2+］i瞬態(tài)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放等功能檢測來探討KATP非特異性開放劑（匹那地爾）對高鉀停搏液處理后大鼠離體心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣與舒縮功能的影響。

材料與方法1藥物與試劑匹那地爾（Pinacidil批號60K1387），格列苯脲(Glibenclamide批號58H0570)，F(xiàn)ura-2/Am(批號108964-32-5),均購自美國Sigma公司。

無鈣Tyrode氏液配制（mmol/L）：NaCl100、KCl10、KH2PO41.2、MgSO4·7H2O5、葡萄糖20、牛磺酸20，3-(N-嗎啉代)丙磺酸10。沖100%O2用KOH(5mol/L)調(diào)至pH7.20。K-H液（mmol/L）：NaCl118.5、NaHCO325、KCl4.75、MgSO41.2,KH2PO41.2、CaCl22.5、葡萄糖11.1。

2左心室單細(xì)胞制備成年SD大鼠20只，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗室提供。雌雄不拘，體重232g～252g，斷頭處死后，迅速開胸取出心臟，置于4℃氧飽和Tyrode氏液中洗凈血液后固定于Langendorff灌流裝置上用95％O2＋5％CO2飽和的K-H液恒溫（37℃）恒流行主動脈逆行灌注，流速10ml/min。酶解法分離心室肌細(xì)胞［5］。先以無鈣Tyrode氏液灌流5min，再以含I型膠原酶0.3g/L的低鈣（50μmol/L）Tyrode氏液灌流5min。取下心臟，去掉心房和基底部組織，將左心室肌剪碎，用吸管緩慢吹打，于含1%牛血清白蛋白的低鈣Tyrode氏液中37℃孵育15min,再將細(xì)胞懸液用直徑200mm單層尼龍網(wǎng)過濾，濾液在無鈣Tyrode氏液中分三步復(fù)鈣至Ca2+濃度為1.25×10-6mol/L［第一次復(fù)鈣：20ml細(xì)胞混懸液+20ml無鈣液+70μl（72mmol/L）鈣母液,10min～15min后吸取上端20ml懸液,第二次復(fù)鈣:20ml細(xì)胞混懸液+20ml無鈣液+14μl（720mmol/L）鈣母液,10min～15min后吸取上端20ml懸液,第三次復(fù)鈣:20ml細(xì)胞混懸液+20ml無鈣液+28μl（720mmol/L）鈣母液，10min～15min后吸取上端20ml懸液，其余部分過濾，10min～15min后吸取上端20ml懸液］。心肌細(xì)胞在室溫下靜置1h～2h后且鏡檢成活率大于80%。

3隨機分組方法對照組（Con組，）：置于無氧乳酸林格氏液;高鉀停搏液組(CP組)：置于含20mmol/LKCl的無氧乳酸林格氏液;匹那地爾組(CP+P組)：置于含20mmol/LKCl和50mmol/L匹那地爾的無氧乳酸林格氏液;格列苯脲拮抗組(CP+P+G組)：置于含20mmol/LKCl、50mmol/L匹那地爾及10mmol/L格列苯脲的無氧乳酸林格氏液。以上各組細(xì)胞均在24℃下保存2h，然后用95％O2＋5％CO2飽和的K-H液復(fù)灌，鏡下選擇橫紋清晰，胞膜光整的桿狀活細(xì)胞來進(jìn)行實驗。匹那地爾和格列苯脲的用量見文獻(xiàn)［6］。

4檢測指標(biāo)

4.1單細(xì)胞舒縮測定100μl細(xì)胞懸液滴于自制灌流槽中并用95％O2＋5％CO2飽和的K-H液持續(xù)灌流（2ml/min）。以0.2Hz頻率，50V強度的電場刺激心肌細(xì)胞，視頻跟蹤計算機系統(tǒng)(MedEase-1，南京美易科技有限公司)檢測舒縮參數(shù)［收縮幅度(dL)，最大收縮速度(+dL/dtmax)，最大舒張速度(-dL/dtmax)和舒張末期長度］。存儲動態(tài)圖像用MedEase軟件分析［5］。心肌細(xì)胞在復(fù)氧、復(fù)灌3min時的各舒縮參數(shù)為基礎(chǔ)值，之后連續(xù)灌注20min,每隔5min測定一次舒縮參數(shù)。

4.2細(xì)胞內(nèi)鈣瞬態(tài)測定用細(xì)胞內(nèi)雙波長鈣熒光系統(tǒng)（T.I.L.L，PhotonicsGmbH,Grfelfing德國）檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，F(xiàn)ura-2/AM為鈣指示劑。先用10-6mol/LFura-2/AM在室溫下負(fù)載30min，在頻率為0.2Hz，強度為50V的電場刺激下產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度峰值為鈣瞬態(tài)。光信號通過T.I.L.L放大器經(jīng)Digidata1200輸入計算機，pClamp7.0軟件分析。熒光激發(fā)波長分別為340nm和380nm，發(fā)射波長510nm，其熒光比值可反映細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度［5］。心肌細(xì)胞在復(fù)氧、復(fù)灌3min時的鈣瞬態(tài)為基礎(chǔ)值，之后連續(xù)灌注20min,每隔5min測定一次鈣瞬態(tài)。

4.3肌漿網(wǎng)內(nèi)貯鈣釋放功能測定［7］復(fù)灌的心肌細(xì)胞在電刺激下穩(wěn)定5min，停止刺激15s加入咖啡因（10mmol/L）［8］?？Х纫蛘T導(dǎo)的鈣峰與電刺激誘導(dǎo)的鈣峰的比值來表示肌漿網(wǎng)內(nèi)貯鈣釋放的