[科普中國]-bcr/abl融合基因

BCR/ABL融合基因是一種抗細(xì)胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，激活多種信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞過度增殖而使細(xì)胞調(diào)控發(fā)生紊亂。 慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic Myelogenous Leukemia,CML）是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病。在受累的細(xì)胞系中可找到Ph標(biāo)記染色體或（和）bcr/abl基因重排。

簡介由t (9；22) (q34；qll)產(chǎn)生的費(fèi)城染色體(Ph)在血液腫瘤中具有重要的診斷和預(yù)后意義，出現(xiàn)于90%以上的CML、30%成人ALL、2%—20%兒童ALL以及少數(shù)AML和MM患者。位于9q34的ABL基因與位于22qll的BCR基因相互易位，形成BCR/ABL和ABL/BCR融合基因。BCR/ABL融合基因是一種抗細(xì)胞凋亡的基因，具有高度酪氨酸激酶活性，激活多種信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞過度增殖而使細(xì)胞調(diào)控發(fā)生紊亂。BCR基因有兩種斷裂位點(diǎn)，在CML中幾乎都為M- BCR位點(diǎn)，而在ALL中大約2/3位m - BCR位點(diǎn)。具有BCR/ABL融合基因的患者預(yù)后差，臨床上可以根據(jù)患者是否存在BCR/ABL融合基因來選擇性地使用分子靶向治療藥物。FISH方法檢測BCR/ABL融合基因具有極高的靈敏度和檢測隱匿型易位的能力1。

BCR/ABL融合基因及其產(chǎn)物分析CML第9號染色體上c-ABL原癌基因易位于第22號染色體上BCR基因區(qū)域，形成1個(gè)新的5'BCR-ABL3'融合基因。后者可轉(zhuǎn)錄8.5kb的mRNA，含3.3 kb BCR的編碼序(5'端)和5.5 kb ABL的編碼順序(3'端)8.5融合mRNA中 BCR-ABL的閱讀框架仍保持?？梢苑g成1條210KDa的蛋白質(zhì)，包括ABL編碼的1104個(gè)氨基酸殘基和BCR編碼的920個(gè)氨基酸殘基。在體外有較強(qiáng)的酪氨酸蛋白激酶活性。Goldman實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BCR-ABL融合基因具有致癌作用。此外一些作者還證實(shí)在體外細(xì)胞培養(yǎng)中能使造血多能干細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。這些新的研究成果肯定了斷在白血病發(fā)病機(jī)制中的重要作用2。

BCR/ABL的異質(zhì)性BCR斷裂點(diǎn)的異質(zhì)性，決定了BCR/ABL產(chǎn)物的分子異質(zhì)性。98%CML的BCR斷裂點(diǎn)在ber(bcr﹣)，主要在BCR14附近3kb區(qū)域內(nèi)。由此形成的BCR/ABL，表達(dá)8.5kbmRNA蛋白。5.8kb bcr區(qū)域是BCR基因的一部分，包括12、13、14和15號4個(gè)外元及相應(yīng)的內(nèi)元。絕大多數(shù)斷裂點(diǎn)位于14號外元上游，則 BCR-ABL融合基因包含BCR1~13號外元；如斷裂點(diǎn)位于14號外元下游，則14號外元也包含在融合基因中。在很少情況下15號外元也包含在內(nèi)(5區(qū))由于轉(zhuǎn)錄后mRNA的剪接作用雖然融合基因有14號外元，但最終表達(dá)產(chǎn)物也可能丟失它2。

基因結(jié)構(gòu)人abl基因位于9號染色體長臂，有1b、1a和2～11共12個(gè)外顯子。轉(zhuǎn)錄始自1b或1a，形成的兩種mRNA長度分別為7kb和6kb，合成的兩種蛋白質(zhì)分子量均約為145，前者定位于細(xì)胞膜，而后者主要在細(xì)胞核內(nèi)。abl主要結(jié)構(gòu)有N端的肉瘤同源2(srchomology，SH2）、SH1。SH2結(jié)合磷酸化的酪氨酸殘基，SH1具有酪氨酸激酶活性。近C端富含酸性氨基酸殘基，可結(jié)合DNA。abl蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。在G0期，abl-Rb蛋白復(fù)合物與DNA結(jié)合。在G1→S轉(zhuǎn)變過程中，Rb被磷酸化，abl與之分離，并激活，使RNA聚合酶磷酸化，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞進(jìn)入S期。bcr基因位于22號染色體長臂，有23個(gè)外顯子。蛋白產(chǎn)物分子量均為160。bcr蛋白第1～63個(gè)氨基酸是二聚體化結(jié)構(gòu)，參與bcr蛋白多聚體的形成。bcr蛋白參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，但詳細(xì)過程還不十分明確。

bcr基因斷裂點(diǎn)集中在三個(gè)區(qū)域：主要(major bcr,M－bcr）、次要（minor bcr,m－bcr）和μ（μ－bcr）區(qū)域。abl基因斷裂位于第1或第2內(nèi)含子。因斷裂點(diǎn)不一，bcr/abl融合基因及其mRNA和蛋白產(chǎn)物呈多樣性。慢性粒細(xì)胞白血病的bcr基因斷裂點(diǎn)常位于M-bcr，主要是b2a2和b3a2，蛋白分子量為210kb。

形態(tài)特點(diǎn)90%以上的CML患者的血細(xì)胞中出現(xiàn)Ph1染色體，t(9；22)(q34；q11），9號染色體長臂上C-abl原癌基因易位至22號染色體長臂的斷裂點(diǎn)集中區(qū)（bcr），形成bcr/abl融合基因。此基因產(chǎn)生一種新的mRNA，編碼的蛋白為P210，P210具有增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性，改變了細(xì)胞多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞微絲機(jī)動蛋白的功能，從而擾亂了細(xì)胞內(nèi)正常的信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞失去了對周圍環(huán)境的反應(yīng)性，并抑制了凋亡的發(fā)生。Ph1染色體和bcr/abl融合基因是CML的分子基礎(chǔ)，并可作為區(qū)分典型CML和非典型CML的診斷指標(biāo)。依據(jù)Ph1染色體和bcr/abl融合基因，可將CML分為3類，第1類為Ph1陽性和bcr/abl陽性，其臨床表現(xiàn)為外周血象白細(xì)胞升高，以骨髓粒細(xì)胞極度增生為主；第2類為Ph1陰性而bcr/abl陽性，這是一組異質(zhì)性疾病，實(shí)際上屬于Ph1陽性的CML范疇；第3類為Ph1和bcr/abl均陰性。前兩者具有相同的臨床表現(xiàn)和血液學(xué)特征，為典型的CML，后者為非典型CML。正確區(qū)分對臨床治療判定預(yù)后有一定的指導(dǎo)作用。

基因檢測Southern Blot

即DNA印跡，可以對bcr-abl融合基因DNA重排進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。將經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切及瓊脂糖電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到固相雜交膜上，胚系DNA會產(chǎn)生特征性片段，但發(fā)生過基因重排的細(xì)胞DNA因酶切位點(diǎn)有所改變會產(chǎn)生有別于胚系的DNA酶切片段。大多數(shù)bcr基因的斷裂點(diǎn)集中于5.8kb的主要斷裂點(diǎn)集簇區(qū)（M-bcr）。從白血病患者白細(xì)胞中抽提的基因組DNA，經(jīng)一組限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用取自M-bcr3’和5’端的bcr探針與之雜交。放射自顯影洗片后即可顯示所要檢測的條帶，對于CML患者，除可見到一條與胚系bcr基因組DNA相對應(yīng)的條帶外，其他的條帶說明存在重排的bcr等位基因。

RT-PCR

采用異硫氫酸胍酚、氯仿一步法提取細(xì)胞總RNA，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增bcr-abl基因接合區(qū)mRNA是檢測CML敏感而特異的方法，設(shè)計(jì)兩對引物，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取擴(kuò)增后產(chǎn)物10μl，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

實(shí)時(shí)定量PCR

PCR擴(kuò)增時(shí)，加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5’～3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而使熒光檢測系統(tǒng)接受到熒光信號。每個(gè)模板的Ct值（即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代表Ct值，然后根據(jù)待測樣本的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣本的起始拷貝數(shù)。

另外bcr/abl融合基因編碼的蛋白P210可以用Western印跡或酶聯(lián)免疫反應(yīng)加以檢測。

治療CML治療的目的是控制血液學(xué)和遺傳學(xué)異常、消除癥狀、最大限度地延長生存。

抑制劑既然酪氨酸激酶在CML的發(fā)生中起了關(guān)鍵作用，抑制其活性成為CML治療的一個(gè)新途徑。已經(jīng)合成了較特異的abl酪氨酸激酶抑制劑，即STI-571（伊馬替尼，格列衛(wèi)）。伊馬替尼是2-苯氨嘧啶衍生物，它可以選擇性地阻斷ATP與Abl激酶結(jié)合位點(diǎn)，有效地抑制bcr-abl激酶底物中酪氨酸殘基的磷酸化，使該酶失活，進(jìn)而阻止了一系列的信號傳導(dǎo)。伊馬替尼也抑制c-kit（干細(xì)胞因子）和PDGFR（血小板衍化生長因子受體）的酪氨酸激酶活性。實(shí)驗(yàn)表明，伊馬替尼不殺傷bcr-abl- 細(xì)胞，只殺傷bcr-abl+ 細(xì)胞。該藥選擇性抑制CML患者粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM) 和爆式紅系集落形成單位（BFU-E）的生長，使骨髓或外周血單個(gè)細(xì)胞半固體培養(yǎng)中集落形成率降低92%～98%，對正常集落的形成沒有影響。伊馬替尼通過抑制bcr-abl活性，使得參與細(xì)胞周期、粘附骨架形成等生理過程的多種基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變，引起bcr-abl+ 細(xì)胞分化、凋亡。

免疫治療機(jī)體抗腫瘤免疫的機(jī)制包括細(xì)胞免疫和體液免疫兩方面，對CML主要以細(xì)胞免疫為主。CML對免疫治療有效，包括INF-α、造血干細(xì)胞移植和供者淋巴細(xì)胞輸注（DLI），其機(jī)制為T細(xì)胞和其他免疫效應(yīng)因子的參與。INF-α通過和細(xì)胞膜受體結(jié)合，激活大量信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)控相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄，抑制白血病細(xì)胞增生、促進(jìn)凋亡。另外干擾素還可通過免疫調(diào)節(jié)，增加染色體陽性細(xì)胞HLA分子的表達(dá)量，結(jié)合的白血病肽段可更有效地被抗原呈遞細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞識別，增加NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能，從而殺傷白血病細(xì)胞。

干細(xì)胞異基因造血干細(xì)胞移植能根除Ph+ 克隆，恢復(fù)正常造血，使大部分CML患者真正達(dá)到治愈。因而仍認(rèn)為治愈CML的唯一方法是異基因造血干細(xì)胞移植。許多因素可影響異基因移植的效果，如患者性別和年齡、移植時(shí)所處的病期、供者來源（相關(guān)或不相關(guān)）、組織相容性及從診斷到移植的時(shí)間等。

移植時(shí)間既往經(jīng)驗(yàn)表明，當(dāng)病情進(jìn)展到加速或急變期后實(shí)施異基因SCT后效果不佳，多數(shù)專家主張應(yīng)在慢性期移植，結(jié)論是CML診斷后盡早（一年內(nèi)）移植。

移植影響有不同觀點(diǎn)，德國CML協(xié)作組的研究顯示移植前停用IFN3個(gè)月以上再做移植，與從未用過IFN的病人做移植的效果相同；移植前3個(gè)月內(nèi)用IFN則增加移植相關(guān)死亡率。

來源與骨髓相比，外周血采集物含有更多的CD34+ 細(xì)胞和10倍以上的淋巴細(xì)胞；移植后中性粒細(xì)胞和血小板的恢復(fù)均較快；慢性移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生率較高和程度較重；移植后白血病復(fù)發(fā)率較低。

T細(xì)胞去除供體的T細(xì)胞可預(yù)防GVHD，其代價(jià)為移植物被排斥率增加，免疫重建延遲、復(fù)發(fā)率增加。對去T細(xì)胞移植后預(yù)防性的輸注供體源的T細(xì)胞可降低復(fù)發(fā)率。

供體選擇HLA相合的同胞供體仍是最佳選擇。其它可供選擇的有HLA相合或大部分相合的親屬供體、HLA相合的無關(guān)供體，HLA相合或大部分相合的臍帶血。非同胞間的配型須采用分子生物學(xué)方法。一般說來，HLA相合同胞間移植的效果優(yōu)于無關(guān)供體移植。

預(yù)防復(fù)發(fā)慢性期移植后5年內(nèi)復(fù)發(fā)率為0～30%，主要取決于移植方案和GVHD預(yù)防方式。去T細(xì)胞處理、GVHD預(yù)防力度強(qiáng)和進(jìn)展加速期移植者復(fù)發(fā)率高。

造血干細(xì)胞移植可使大部分CML患者獲得治愈，但仍有少數(shù)病例會出現(xiàn)復(fù)發(fā)，DLI為復(fù)發(fā)的治療提供了新的方法。異基因造血干細(xì)胞移植能治愈經(jīng)選擇的CML患者，其治療作用依賴于移植物抗白血病作用，疾病復(fù)發(fā)后DLI可以重新誘導(dǎo)出現(xiàn)移植物抗白血病作用，并增強(qiáng)此作用，從而通過增強(qiáng)免疫治療控制疾病復(fù)發(fā)。

本詞條內(nèi)容貢獻(xiàn)者為:

江松敏 - 副教授 - 復(fù)旦大學(xué)