菌落總數(shù)

概念

菌落總數(shù)是食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下(如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等)培養(yǎng)后，所得每g(mL)檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。

單位

菌落形成單位叫做CFU。CFU的含義是形成菌落的菌落個數(shù)，不等于細菌個數(shù)。（比如兩個相同的細菌靠得很近或貼在一起，那么經(jīng)過培養(yǎng)這兩個細菌將會形成一個菌落，此時就是2個細菌，1CFU）。菌落總數(shù)往往采用的是平板計數(shù)法，經(jīng)過培養(yǎng)后我們數(shù)出平板上所生長出的菌落個數(shù)，從而計算出每毫升或每克待檢樣品中可以培養(yǎng)出多少個菌落，于是以CFU/ml或CFU/g報告之1。

作用

菌落主要作為判定食品被污染程度的標志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細菌對食品被污染程序的標志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細菌在食品繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)2。

危害

食品的菌落總數(shù)嚴重超標，說明其產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況達不到基本的衛(wèi)生要求，將會破壞食品的營養(yǎng)成分，加速食品的腐敗變質(zhì)，使食品失去食用價值。消費者食用微生物超標嚴重的食品，很容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等癥狀，危害人體健康安全。

但需要強調(diào)的是，菌落總數(shù)和致病菌有本質(zhì)區(qū)別，菌落總數(shù)包括致病菌和有益菌，對人體有損害的主要是其中的致病菌，這些病菌會破壞腸道里正常的菌落環(huán)境，一部分可能在腸道被殺滅，一部分會留在身體里引起腹瀉、損傷肝臟等身體器官，而有益菌包括酸奶中常被提起的乳酸菌等。但菌落總數(shù)超標也意味著致病菌超標的機會增大，增加危害人體健康的幾率2。

檢驗方法

菌落總數(shù)的測定，一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時間后（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含細菌菌落總數(shù)。

國內(nèi)外菌落總數(shù)測定方法基本一致，從檢樣處理、稀釋、傾注平皿到計數(shù)報告無何明顯不同，只是在某些具體要求方面稍有差別，如有的國家在樣品稀釋和傾注培養(yǎng)進，對吸管內(nèi)液體的流速，稀釋液的振蕩幅度、時間和次數(shù)以及放置時間等均作了比較具體的規(guī)定。

檢驗步驟

樣品的稀釋

固體和半固體樣品：稱取25g樣品置于盛有225mL無菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1：10的樣品勻液。

液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mL無菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)可預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1：10的樣品勻液。

用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），在振蕩器上振蕩混勻，制成1：100的樣品勻液。制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。

根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇1個~3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），吸取1mL樣品勻液于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。同時，分別吸取1mL.空白稀釋液加入兩個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。

及時將15mL~20mL冷卻至46℃~50℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于48℃±2℃恒溫裝置中保溫）傾注培養(yǎng)皿，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混合均勻。

培養(yǎng)

水平放置待瓊脂固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃士1℃培養(yǎng)48h士2h，水產(chǎn)品30℃士1℃培養(yǎng)72h±3h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面蔓延生長的菌落，可在凝固后的瓊脂培養(yǎng)基表面覆蓋一薄層平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，進行培養(yǎng)。如使用菌落總數(shù)測試片，應(yīng)按照測試片所提供的相關(guān)技術(shù)規(guī)程操作。

菌落計數(shù)

可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colonyformingunit，CFU）表示。選取菌落數(shù)在30CFU~300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無較大片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。

傾注培養(yǎng)

1．操作方法：根據(jù)標準要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。

將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。

待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。

2．傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。

傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。

3．為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。。

4．培養(yǎng)溫度一般為37℃（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30℃）。培養(yǎng)時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15%。

5．為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。

在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。

注意事項：

（1）操作要快而準，包括材料、加樣、倒培養(yǎng)基。

（2）吸液體時液體不能進入吸頭。

（3）樣品稀釋時一定要混勻。

（4）倒培養(yǎng)基前，瓶口要過火焰。

（5）一定要有空白對照。

（6）培養(yǎng)基溫度控制，培養(yǎng)基薄厚。

（7）檢測時一定要使平皿完全暴露于空氣中。

計數(shù)和報告

1．操作方法：培養(yǎng)到時間后，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算出原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進行報告。

2．到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。

3．計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板（SN標準要求為25~250個菌落），若有二個稀釋度均在30~300之間時，按國家標準方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告）。

4．若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告。

5．不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。

6．當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。

7．當計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。

8．菌落數(shù)的報告，按國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克（g）為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm）報告。

超標事件

2009年8月，河南省鄭州市食品藥品安全委員會辦公室公布樂百氏薄荷水菌落總數(shù)超標。

2009年10月，國家質(zhì)檢總局網(wǎng)站公布了對200種豆制品產(chǎn)品的抽查結(jié)果，有18款產(chǎn)品不合格登上了“黑名單”，其中，“川妹子”鹵香豆干菌落總數(shù)超過標準限量近70倍。

2010年8月，國家質(zhì)檢總局進出口食品安全局公布一批次進口自美國的“品客”薯片被發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)超標。

2010年10月，天津市工商行政管理局公布標稱鄭州上好佳食品工業(yè)有限公司“上好佳”谷維精華綠茶餅干菌落總數(shù)超標。

2011年6月，國家質(zhì)檢總局公布山西娃哈哈昌盛飲料有限公司生產(chǎn)的白葡萄汁飲品菌落總數(shù)超標。

2011年8月，北京全市停售“雨潤”老北京烤鴨、“福聚興”烤鴨、“大東老曹”牌烤鴨等4種菌落總數(shù)超標產(chǎn)品。

2011年10月，北京市食品安全辦公室公布北冰洋雙把雪糕因菌落總數(shù)超標停售。

2011年11月，蒙?！半S變榛子巧克力雪糕”在“菌落總數(shù)、大腸菌群”兩個重要微生物指標中超標。

2011年12月，深圳市場監(jiān)督管理局公布包括“煌上煌”、“絕味”、“周黑鴨”等知名品牌熟制鴨脖的大腸菌群和菌落總數(shù)超標。

2012年1月，波力食品工業(yè)（昆山）有限公司生產(chǎn)的“波力海苔”（11.2g/包調(diào)味紫菜）被檢測出菌落總數(shù)超標。

2012年1月，北京市食品安全辦公室公布老才臣家庭裝火鍋調(diào)料火鍋蘸料菌落總數(shù)超標5倍有余。

2012年1月，食品安全監(jiān)管部門抽檢“滿記甜品”出售的芒果布丁因大腸桿菌超標近3倍，菌落總數(shù)超標13倍被下架。

2012年4月，北京市食品安全辦通報，“恒翔”鄉(xiāng)巴佬麻辣美味香干，因菌落總數(shù)實測值是標準值的26倍而停售。并且已購買不合格食品的消費者，可憑購物小票和食品外包裝向銷售單位退貨。

2012年4月，上海市食品安全委員會辦公室通報，上海虹口糕團食品廠生產(chǎn)的青團（300克/袋）、上海麥園食品廠生產(chǎn)的“麥園”艾草糕團（250克/包）、上海華榕食品有限公司生產(chǎn)的“阿呆閑品”青團（計量稱重）、上海三香食品有限公司食品廠生產(chǎn)的“萬壽齋”青米團（400克/盒）的菌落總數(shù)超標，已停止銷售。

2012年7月23日，光明乳業(yè)再曝乳品菌落超標，并表示，菌落總數(shù)超標的原因為長途運輸過程中擠壓受損、加上銷售環(huán)境的溫度不穩(wěn)定所致。

2012年9月，網(wǎng)傳戴耳機等于養(yǎng)細菌，專家證明戴耳機會加速細菌繁殖，導(dǎo)致菌落總數(shù)超標，耳機應(yīng)常消毒。