葡萄霜霉菌的抗藥性檢測與科學(xué)用藥

一、葡萄霜霉病的為害癥狀

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葡萄霜霉病是由葡萄霜霉菌［Plasmopara Viticola (Berk et Curtis) Ber.et de Toni］引起的一種世界性病害。目前，世界上幾乎所有葡萄產(chǎn)區(qū)都有葡萄霜霉病發(fā)生。葡萄霜霉病主要危害葉片，也能侵染新梢、卷須、葉柄及幼果等綠色幼嫩組織。葉片感病初期在正面形成淡黃色水漬狀邊緣不清晰的小斑點，以后逐漸擴大為褐色不規(guī)則形或多角形病斑，數(shù)斑相連變成不規(guī)則形大斑。天氣潮濕時，在病斑背面產(chǎn)生白色霜霉狀物，即病菌的孢囊梗和孢子囊。發(fā)病嚴重時病葉早枯早落。嫩梢被侵染后，初期出現(xiàn)顏色深淺不一的淡黃色水漬狀斑點，后變?yōu)楹稚园枷莸牟“?，潮濕時病斑也產(chǎn)生白色霜霉。病重時新梢扭曲，生長停止，甚至枯死。卷須、穗軸、葉柄有時也能被害，其癥狀與嫩梢相似。幼果被害，病部褪色，變硬下陷，上生白色霜霉，很易萎縮脫落，隨著果粒變大，病菌侵染機率降低，且侵染后病原菌發(fā)育緩慢，可導(dǎo)致果粒表面形成凹形，逐漸變紫，僵硬，皺縮，極易脫落（圖1）。

圖1葡萄霜霉菌的為害癥狀

二、葡萄霜霉菌的抗藥性情況

病原菌的抗藥性是指目標生物個體或群體，在連續(xù)接觸某種藥劑一定時間后，對該藥劑發(fā)生可遺傳的敏感性降低，使藥效降低或失去防效的現(xiàn)象。葡萄霜霉病是氣傳性的流行性病害，化學(xué)防治是病害防控中最為重要的手段之一。葡萄生產(chǎn)上常用的內(nèi)吸性殺菌劑主要有甲氧基丙烯酸酯類（嘧菌酯）、羧酸酰胺類（烯酰嗎啉）、苯基酰胺類（甲霜靈）、氰基乙酰胺類（霜脲氰）和磺胺咪唑類（氰霜唑）。由于化學(xué)藥劑科學(xué)使用技術(shù)的不完善、使用者相關(guān)知識的缺乏以及田間用藥不合理等導(dǎo)致防治葡萄霜霉菌多種化學(xué)藥劑產(chǎn)生抗藥性，防效正在急劇下降，嚴重威脅著葡萄產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

三、葡萄霜霉菌抗藥性檢測技術(shù)

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究葡萄有害生物研究組利用葉盤漂浮法檢測了不同產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉菌對不同藥劑的抗性，同時還研發(fā)了Taqman-MGB檢測技術(shù)，該技術(shù)不受實驗材料、培養(yǎng)環(huán)境等外界條件限制，具有方法穩(wěn)定、檢測效率高、靈敏度較高、特異性強、假陽性低等優(yōu)點。

1、傳統(tǒng)檢測方法—葉盤漂浮法（圖2）

（1）樣品的采集及處理： 將在田間采集的新鮮葡萄霜霉菌病樣，室內(nèi)重新培養(yǎng)出新鮮的菌層；

（2）制作葉盤：選擇健康的‘里扎馬特’新鮮嫩葉并進行葉片表面消毒，在超凈工作臺中用直徑15 mm的打孔器將其打成葉盤，將葉盤輕放到相應(yīng)濃度的藥液中，葉背面朝上，每皿10個葉盤，對照組采用無菌水代替藥液；

（3）接種霜霉菌：將純培養(yǎng)后新鮮的霜霉菌配制成濃度為1 × 106個/ml的孢子懸浮液，滴在葉盤中央，每個葉盤滴10 μl；

（4）培養(yǎng)及結(jié)果調(diào)查：將其置于培養(yǎng)箱中黑暗處理24 h，然后用滅過菌的濾紙條將葉盤背面的液滴吸去，后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d后調(diào)查結(jié)果。根據(jù)發(fā)病情況判斷抗藥性情況。

圖2葉盤法測定抗藥性示意圖

2、分子生物技術(shù)檢測- Taqman-MGB抗藥性檢測技術(shù)

根據(jù)葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉和嘧菌酯產(chǎn)生抗藥性后發(fā)生基因突變的原理建立了Taqman-MGB檢測技術(shù)。

（1）樣品的采集及處理： 將在田間采集的新鮮葡萄霜霉菌病樣，在室內(nèi)保濕培養(yǎng)新的霉層；

（2）霜霉菌DNA的提?。豪肊-Z○R96 Fungal DNA Kit提取試劑盒進行提??；

（3）利用已開發(fā)的Taqman-MGB探針，通過熒光定量PCR檢測不同葡萄產(chǎn)區(qū)霜霉菌的抗藥性。

四、檢測結(jié)果

1.采用葉盤法檢測了部分產(chǎn)區(qū)霜霉菌對甲霜靈、氰霜唑及霜脲氰的抗性情況，此方法對試驗設(shè)備要求低、操作簡單、節(jié)省材料、與田間發(fā)病反應(yīng)最為近似(圖3）。

圖3 葉盤法檢測結(jié)果

2. 采用Taqman-MGB分子檢測技術(shù)進行了部分葡萄產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉菌對嘧菌酯和烯酰嗎啉抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)抗性差異明顯，遼寧北鎮(zhèn)霜霉菌群體對QoI抗性達到100%，而山西群體QoI抗性頻率為4%（圖4）。對于CAA類殺菌劑，遼寧北鎮(zhèn)霜霉菌群體抗性等位基因頻率達到96%，其中雜合子敏感型站到45%，抗性菌株為51%（圖5），說明抗性群體正在這一區(qū)域迅速蔓延，此方法能夠準確區(qū)分野生型，抗藥突變型與雜合型，靈敏度達到1pg，并且除了單菌株鑒定之外，還可以進行混合樣品定量檢測，能夠大大減輕工作量，提高效率，適合于具有熒光定量PCR的實驗室應(yīng)用。

圖4 Taqman-MGB探針檢測QoI抗性

圖5 Taqman-MGB探針檢測CAAs抗性

根據(jù)檢測結(jié)果，遼寧北鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)不能繼續(xù)用嘧菌酯和烯酰嗎啉防治霜霉病，建議更換其他防治霜霉病的藥劑，并注意連續(xù)使用次數(shù)，一般同一種藥劑連續(xù)使用不能超過3次；山西產(chǎn)區(qū)可以繼續(xù)使用這兩種藥劑防控葡萄霜霉病，但注意藥劑間的輪換使用。抗藥性的檢測不僅為霜霉病的防治打下基礎(chǔ)，還為農(nóng)藥精準選擇、合理輪換使用殺菌劑，降低農(nóng)藥使用量提供科學(xué)指導(dǎo)意見。

作者：孔繁芳 王忠躍 劉永強 張昊（中國農(nóng)科院植保所）

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