諾獎(jiǎng)青睞的觸覺研究是怎么做出來的？| Piezo封神之路（上）

撰文 | 劉文豪

2010年，美國Scripps研究所的Ardem Patapoutian課題組在《科學(xué)》雜志報(bào)道了哺乳動物中首類介導(dǎo)陽離子內(nèi)流的機(jī)械門控離子通道——Piezo蛋白家族[1]，平地驚雷般地開啟了一個(gè)領(lǐng)域。因與觸覺等關(guān)鍵的基礎(chǔ)機(jī)械感覺關(guān)系密切，該蛋白自發(fā)現(xiàn)伊始便作為明星分子活躍在各大學(xué)術(shù)期刊上。Ardem更是因這一發(fā)現(xiàn)被授予2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)！筆者的導(dǎo)師肖百龍教授曾是Ardem的博后，他見證和參與了Piezo蛋白早期研究的關(guān)鍵工作，獨(dú)立后在這一領(lǐng)域繼續(xù)深耕，因而我有幸進(jìn)入到這一熱火朝天的領(lǐng)域中。Piezo蛋白究竟是什么？它們是如何工作的？它們的重要性在哪兒？帶著這些問題，讓我們一起進(jìn)入Piezo的世界，一窺科學(xué)家們逐步認(rèn)識Piezo蛋白的過程。

圖1. Ardem Patapoutian因其在觸覺感知領(lǐng)域的重要貢獻(xiàn)獲得2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)丨圖片來自諾貝爾獎(jiǎng)委員會官網(wǎng)

我們對這個(gè)世界最初的感知通常是從觸覺開始的。第一聲啼哭之前，嬰兒經(jīng)歷過誘發(fā)哭聲的拍打；來到人世，感受親人的愛撫和擁抱；兒時(shí)抓周一通亂摸，成長中提筆、拍球、彈撥樂器；日常生活中握手，敲擊鼠標(biāo)鍵盤，刷手機(jī)……觸覺充斥著我們?nèi)粘Ｉ畹姆椒矫婷妗?/p>

觸覺是軀體機(jī)械感覺的一種，除了觸覺之外，還有機(jī)械痛（區(qū)別于日常的輕觸覺）、本體感覺（對四肢移動和體位的感知）等也屬于軀體機(jī)械感覺。這些機(jī)械感覺和視覺、嗅覺、味覺和聽覺構(gòu)成了我們?nèi)粘Ｒ饬x上的五感（聽覺也是感知聲波振動的一種機(jī)械感覺）。

圖2. 五種感覺丨圖片來自Bing

這些基本感覺從形成、傳遞到感知，生物學(xué)過程大體上是類似的：特定的感受器官和細(xì)胞上特定的受體接收外界刺激，產(chǎn)生動作電位，這種電信號沿神經(jīng)突觸向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞，最后到達(dá)大腦特定區(qū)域，就產(chǎn)生了特定的感覺。在這一過程中，作為最初級受體的一系列蛋白質(zhì)是十分神奇的存在。

人體的蛋白質(zhì)都是由20種基本的氨基酸組成?？删褪莾H僅憑借這20種基本組件的排列組合，生物居然能演化出如此精準(zhǔn)強(qiáng)大的、感知外界各種物理化學(xué)信號的接收器——受體蛋白。以人類為例，眼睛中的光敏感受體可響應(yīng)380-780nm波長的電磁波；鼻子中的嗅覺受體可幫助我們分辨出空氣中的數(shù)萬種小分子；味蕾上的味覺受體可分辨苦咸酸甜鮮；人耳中聲波的受體可以分辨出各種不同響度、頻率和音色的聲音；遍布全身的觸覺受體能幫我們精確分辨出壓力、振動、紋理等多種不同的觸覺感受。而在動物中，這些受體的功能往往比人類更加強(qiáng)大。因此，鑒定出這些受體究竟由何種蛋白構(gòu)成，一直都是神經(jīng)科學(xué)家們孜孜以求的關(guān)鍵目標(biāo)。

視覺上的研究首開先河，視網(wǎng)膜上的感光蛋白（視紫紅質(zhì)）被德國科學(xué)家在19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)，而后在上世紀(jì)80年代確定了全長DNA序列[2, 3]。接著，仿照研究視覺受體的辦法，科學(xué)家們相繼鑒定到嗅覺和味覺受體的分子基礎(chǔ)[4, 5]，其中嗅覺受體的工作獲得了2004年諾貝爾獎(jiǎng)。這三種感覺的受體蛋白或在相應(yīng)感官中高表達(dá)，或在基因序列上有高同源性（三者均屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族），這兩個(gè)特點(diǎn)為它們的鑒定提供了條件。

至于余下的兩種機(jī)械感覺，造物主似乎給我們出了難題：觸覺和聽覺的受體蛋白的低表達(dá)給生化鑒定帶來困難，且在基因序列上也不像視味嗅覺般有章可循[6]。憑借遺傳篩選，科學(xué)家得以在較低等的生物中鑒定到部分機(jī)械感覺通道(細(xì)菌中的機(jī)械通道MscL倒是生化方法獲得的[7])。

而在哺乳動物中，這個(gè)疑問一直持續(xù)到2010年。這一年，Ardem課題組鑒定到了哺乳動物中首類介導(dǎo)陽離子內(nèi)流的機(jī)械門控Piezo陽離子通道[1]，解決了謎題。這一里程碑式的發(fā)現(xiàn)為觸覺受體的分子基礎(chǔ)提供了可能的解釋。后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，Piezo家族中的Piezo2確實(shí)參與觸覺感知。

如此重要的一類蛋白是如何千呼萬喚始出來的？它的功能是怎樣被一步步揭示出來的？今天，我們將從分子水平來講述Piezo這棟大廈的地基是如何打下的。

在當(dāng)代生物學(xué)研究中，一個(gè)好的工作，往往都需要由淺入深地逐步上升到分子水平。具體來說，需要揭示這一過程的各個(gè)部分：一個(gè)生物學(xué)現(xiàn)象的組織器官基礎(chǔ)，與之相關(guān)的細(xì)胞，細(xì)胞上行使功能的蛋白，以及編碼該蛋白的基因。蛋白質(zhì)和基因這種分子水平的研究是一個(gè)領(lǐng)域的基石。

電光火石——機(jī)械力能直接打開離子通道

哺乳動物細(xì)胞能產(chǎn)生數(shù)萬種蛋白，如何從中發(fā)現(xiàn)機(jī)械敏感蛋白？我們不妨先把問題轉(zhuǎn)化成：哪些蛋白可能響應(yīng)機(jī)械力？

機(jī)械力勢必引發(fā)細(xì)胞形態(tài)的改變，因此，和細(xì)胞膜有密切關(guān)系的蛋白都能成為懷疑對象，包括直接定位在細(xì)胞膜上的膜蛋白、支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞骨架蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)等。

1979年，研究人員用電生理的方法，在牛蛙的聽覺上皮細(xì)胞記錄到了機(jī)械力刺激下產(chǎn)生的電流[8]。由于刺激后電流產(chǎn)生的時(shí)間在亞毫秒級別（40μs），這個(gè)電光火石的瞬間不足以讓細(xì)胞內(nèi)第二信使完成信號傳遞（上述的視覺嗅覺味覺的G蛋白偶聯(lián)受體就需要借助第二信使產(chǎn)生電流），所以只能是目的蛋白受到機(jī)械力后直接產(chǎn)生了電流。這個(gè)潛在的機(jī)械敏感蛋白，最可能是離子通道[8, 9]。

離子通道是膜蛋白的一種，一般由跨越細(xì)胞膜內(nèi)外的孔道區(qū)域和其他輔助元件組成。在受到適當(dāng)刺激時(shí)，孔道區(qū)域可打開，依據(jù)離子通道對不同離子的選擇性和細(xì)胞膜內(nèi)外不同離子的電化學(xué)梯度，使部分離子穿越細(xì)胞膜，帶來細(xì)胞膜電位的變化，或由離子自身參與信號傳遞而形成生物學(xué)效應(yīng)。

無獨(dú)有偶，1984年，研究人員在雞的骨骼肌細(xì)胞中記錄到了由牽拉所致的機(jī)械敏感電流，該電流也被認(rèn)為由離子通道介導(dǎo)[10]。

搜尋范圍由此大大縮小——離子通道中就存在著機(jī)械敏感蛋白。

圖3. 機(jī)械力驅(qū)動離子通道打開完成陽離子內(nèi)流丨圖片改編自Hoffman, et al., 2011, Nature[11]

上下求索——你究竟是誰？

和G蛋白偶聯(lián)受體家族不同，不同的離子通道在序列和功能上彼此之間差異巨大，唯一被認(rèn)可的共性是：都含有兩次以上的跨膜區(qū)[1]（膜蛋白都需要插入細(xì)胞膜的跨膜區(qū)，來定位在細(xì)胞膜上，最常見的跨膜區(qū)是α螺旋）。

如何判定一個(gè)通道是機(jī)械門控離子通道呢？科學(xué)家們制定了以下幾條準(zhǔn)則：該通道要能直接被機(jī)械力激活而無需通過中間信使；該通道參與機(jī)體機(jī)械傳導(dǎo)的過程；在非機(jī)械敏感細(xì)胞中表達(dá)該通道能賦予該細(xì)胞機(jī)械敏感性；該蛋白有成孔區(qū)和機(jī)械敏感區(qū)[12, 13]。

此等嚴(yán)苛的標(biāo)準(zhǔn)，加上機(jī)械敏感通道常常低表達(dá)的特性，使得常規(guī)生化手段束手無策，僅在高表達(dá)的細(xì)菌機(jī)械敏感通道MscL的鑒定中方有用武之地[7]。而后世找尋其他真核生物的機(jī)械通道大都經(jīng)由遺傳篩選得到。遺傳篩選是基于中心法則——蛋白質(zhì)是由基因編碼產(chǎn)生。在個(gè)體或者細(xì)胞中，讓感興趣的基因發(fā)生變異，從而導(dǎo)致該基因?qū)?yīng)的、行使生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)發(fā)生變異或不再表達(dá)，如果此時(shí)機(jī)械感覺相關(guān)的表現(xiàn)異常，那么該基因就很能作為備選基因。

在易于進(jìn)行遺傳操作的低等物種中，遺傳篩選幫助我們確認(rèn)了部分機(jī)械門控離子通道，比如線蟲里的DEG/ENaC通道[14, 15]、果蠅的NOMPC通道[16]。而在脊椎動物，尤其是哺乳動物中，要確定機(jī)械敏感蛋白，可以尋找這些低等物種機(jī)械通道的同源蛋白。但這種方法收效甚微：哺乳動物中或是不存在相關(guān)的同源基因，而有同源基因的，其表達(dá)的蛋白卻沒有機(jī)械敏感性。此前唯一確定的哺乳動物機(jī)械敏感蛋白——K2P家族的作用是使細(xì)胞超極化而變得更加“平靜”[17]，可是觸覺、聽覺過程需要讓細(xì)胞去極化而“興奮”起來。

那么，我們苦苦找尋的這種受體究竟是什么呢？

學(xué)界路漫漫，上下而求索。

平地驚雷——Piezo蛋白橫空出世

故事開始于十多年前。彼時(shí)，Ardem實(shí)驗(yàn)室的博士后Bertrand Coste接下找尋哺乳動物機(jī)械門控離子通道這一極具挑戰(zhàn)的課題。此前他們已經(jīng)知道一種鼠源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（N2A細(xì)胞）是有較強(qiáng)機(jī)械敏感性的：玻璃尖頭戳細(xì)胞的力刺激和抽吸細(xì)胞膜的力刺激均能引發(fā)穩(wěn)定電流。他們試圖從這種細(xì)胞出發(fā)，尋找那個(gè)隱藏在重重迷霧里的機(jī)械敏感通道。

細(xì)胞系易于在體外大量培養(yǎng)，且細(xì)胞之間一致性很高，這樣的特點(diǎn)允許我們鑒定到細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的基因。借助基因芯片，N2A細(xì)胞系內(nèi)高表達(dá)的基因被確定。再結(jié)合離子通道“至少有兩次跨膜”這一特點(diǎn)，他們挑選出一系列備選基因。進(jìn)一步的，他們用RNA干擾技術(shù)逐個(gè)抑制備選基因表達(dá)，如果某個(gè)基因抑制后的N2A細(xì)胞失去機(jī)械敏感性，那么該基因表達(dá)的蛋白極有可能就是那個(gè)受體。

事情就這樣成了！在Bertrand口中的那個(gè)“美妙的時(shí)刻”，列表中的第72個(gè)基因被抑制后，N2A的機(jī)械敏感電流顯著下降！這個(gè)原名Fam38A的基因后來被命名為Piezo1，同一家族的另一個(gè)蛋白Fam38B被命名為Piezo2。Piezo一詞起源于希臘語，有“壓力、擠壓”的意思，用它做名字，寓意該基因是壓力受體。

進(jìn)一步的，他們將Piezo表達(dá)在幾無機(jī)械敏感性的HEK293T細(xì)胞系中，成功賦予其機(jī)械敏感性。同時(shí)，又在哺乳動物傳導(dǎo)機(jī)械感覺的背根神經(jīng)節(jié)中，發(fā)現(xiàn)了Piezo2的高表達(dá)，提示了Piezo2和觸覺、痛覺感知的密切關(guān)系[1]。

圖4. 機(jī)械敏感蛋白Piezo1的鑒定（點(diǎn)擊看大圖）

A，用“戳”的機(jī)械力刺激細(xì)胞的電生理實(shí)驗(yàn)設(shè)置。記錄電極與細(xì)胞形成全細(xì)胞記錄模式，玻璃刺激電極在電驅(qū)動下戳細(xì)胞。B，上圖，在N2A細(xì)胞中，戳細(xì)胞可誘發(fā)內(nèi)向電流。下圖，用RNAi技術(shù)抑制Piezo1表達(dá)后，N2A細(xì)胞的機(jī)械敏感電流大幅降低。C，過表達(dá)Piezo1的HEK293T細(xì)胞展示出顯著的機(jī)械敏感性。（圖B, C改編自Coste, et al., 2010, Science[1]）

這是一件平地驚雷的大事！從此哺乳動物機(jī)械力受體研究的歷史煥然一新！Piezo蛋白是哺乳動物細(xì)胞具有機(jī)械敏感性的充分必要條件！

然而，這個(gè)研究并不是完美的，它僅證明到Piezo是機(jī)械門控陽離子通道至關(guān)重要的部分。

那么，Piezo蛋白就是那個(gè)通道嗎？

生化藝術(shù)——真的是通道

上述研究雖然證明了Piezo蛋白對于機(jī)械敏感電流的出現(xiàn)不可或缺，但不能排除一種可能：Piezo只是這個(gè)機(jī)械敏感通道的一部分，僅有輔助和調(diào)節(jié)功能。那么，Piezo本身就足以實(shí)現(xiàn)通透離子的通道功能嗎？或者說，Piezo蛋白就是這個(gè)機(jī)械敏感陽離子通道的通道區(qū)嗎？

一個(gè)證據(jù)來自果蠅。研究發(fā)現(xiàn)，果蠅Piezo和鼠的Piezo在一些和孔道直接相關(guān)的性質(zhì)上有較大差異，比如通道的電導(dǎo)和抑制劑作用能力很不相同。這說明，Piezo的來源不同，孔道相關(guān)的電生理特性不同，這暗示著Piezo本身就是通道[18]。

而更直接的方法是：直接提取純的Piezo蛋白，并重組到人造的類似細(xì)胞膜的脂質(zhì)體上。如果仍能記錄到電流，那便證據(jù)確鑿。

這就要求我們能提取出保持生理功能的Piezo蛋白——這個(gè)步驟稱為“蛋白純化”。

蛋白的純化需要依據(jù)每種蛋白的特點(diǎn)量身定制，膜蛋白提取更是其中很棘手的一類。Piezo是很大的蛋白：超過2500個(gè)氨基酸，預(yù)測有30次以上的跨膜[1]。并且，離子通道經(jīng)常以多聚體形式發(fā)揮功能，使提純難度進(jìn)一步增加。因此，Piezo蛋白的純化非生化功力深厚者不可為之。

彼時(shí)，Ardem實(shí)驗(yàn)室的另一個(gè)博士后，肖百龍博士，憑借其扎實(shí)的生化技術(shù)，解決了這一難題。純化的鼠源Piezo1重組入人工脂質(zhì)體后，確實(shí)記錄到了通道開放產(chǎn)生的電流，且該電流能被釕紅（一種廣譜陽離子通道抑制劑）阻斷[18]。后續(xù)的工作進(jìn)一步證明了重組脂質(zhì)體下的Piezo有機(jī)械敏感性[19]。

至此，Piezo蛋白可以被名正言順的稱為“機(jī)械門控Piezo離子通道”。

圖5. Piezo1是離子通道

A，純化的Piezo1蛋白的免疫印跡電泳圖（western blot），圖中黑色條帶即為Piezo1蛋白的條帶。B，上圖，將純化后的Piezo1蛋白重組到人工脂質(zhì)體上后可記錄到通道開放事件。下圖，該通道開放事件可被廣譜陽離子通道阻斷劑釕紅（RR）所阻斷。（圖片改編自Coste and Xiao, et al., 2012, Nature[18]）

眼見為實(shí)——電子顯微鏡下的三葉螺旋槳

Piezo通道在進(jìn)化上是保守的，從植物到動物都有這一蛋白[1]。但在同一個(gè)體內(nèi)，它和其他的蛋白都不相似。那這個(gè)全新的蛋白長什么樣呢？它究竟有怎樣的架構(gòu)，竟能感知機(jī)械力？以及，它是如何傳遞機(jī)械力，來打開通道的？

單單基于氨基酸一級序列的諸多猜測和實(shí)驗(yàn)都不如親眼所見。此時(shí)，Piezo研究呼喚結(jié)構(gòu)生物學(xué)登上舞臺。

在首篇Piezo論文（2010年）問世后的兩三年，冷凍電子顯微鏡技術(shù)發(fā)生了質(zhì)的飛躍。貝葉斯方法的引入和直接電子檢測相機(jī)（DDD）的使用，讓冷凍電鏡能夠解析近原子分辨率的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。2013年，加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的程亦凡博士率先使用冷凍電鏡解析了TRPV1離子通道（2021年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的另一主角）近原子分辨率結(jié)構(gòu)[20]，這為其他通道結(jié)構(gòu)的解析打入了一針強(qiáng)心劑。

2013年，肖百龍博士來到清華大學(xué)組建實(shí)驗(yàn)室，恰逢施一公、王宏偉等人布局、搭建了強(qiáng)大的冷凍電鏡平臺。肖百龍決定與清華的結(jié)構(gòu)研究者們合作解析Piezo通道的三維結(jié)構(gòu)。并率先獲得了Piezo1的中等分辨率結(jié)構(gòu)[21]。冷凍電鏡技術(shù)的突破同樣吸引了Ardem和Rod Mackinnon（2003年諾獎(jiǎng)得主）的目光，二人隨即也投入到Piezo結(jié)構(gòu)解析的工作中。一切都如此順理成章——合適的人，合適的時(shí)間，合適的技術(shù)手段——接下來的幾年，三方（肖百龍/李雪明，Ardem Patapoutain/Andrew B. Ward，Rod Mackinnon）幾乎同時(shí)獲得了Piezo1的高分辨率結(jié)構(gòu)[22-24]，而Piezo2的高分辨率結(jié)構(gòu)也隨后為肖/李合作解出[25]。

Piezo的造型十分獨(dú)特。它是由三個(gè)單體組成的三葉螺旋槳狀結(jié)構(gòu)，多達(dá)114次跨膜，是已知跨膜次數(shù)最多的一類大型膜蛋白。蛋白單體前36次跨膜以每4個(gè)跨膜區(qū)組成一個(gè)單元，共有9個(gè)重復(fù)性的單元，最后兩個(gè)跨膜區(qū)被認(rèn)為形成孔道。蛋白整體由外周槳葉部分向中心凹陷成穹頂狀（直徑28nm，深10nm），中心孔道區(qū)域上方有一胞外的帽子結(jié)構(gòu)域（Cap），細(xì)胞內(nèi)側(cè)有一9nm長的長桿結(jié)構(gòu)（Beam），將槳葉外周連接到中心孔道的胞內(nèi)部分[21-25]。

著名物理學(xué)家費(fèi)曼說過：“你只要看到它，你就能回答許多基本的生物學(xué)問題。”

Piezo通道這般別致的結(jié)構(gòu)能告訴我們什么呢？

圖6. Piezo2冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)卡通圖（圖片改編自Wang, et al., 2019, Nature[23]）

逐鹿中原——Piezo通道如何感知力？

結(jié)構(gòu)決定功能，世間萬物大抵如此。

Piezo這個(gè)三葉螺旋槳打開過程中發(fā)生了怎樣的變化？研究人員有理有據(jù)的“腦洞大開”。

Piezo的外周槳葉能將周圍的細(xì)胞膜向內(nèi)扭曲凹陷，而其他膜蛋白周圍的膜成分一般是平的，這一異乎尋常的現(xiàn)象讓研究人員們猜測：機(jī)械力作用在Piezo上的時(shí)候是不是會將該凹陷展平呢[26]？2003年諾獎(jiǎng)得主Rod Mackinnon的課題組發(fā)表了兩篇文章，論證了展平的可行性以及模型[24, 27]，之后還利用原子力顯微鏡進(jìn)一步驗(yàn)證[28]。

依托結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的功能機(jī)制研究，肖百龍課題組發(fā)表了系列文章來揭示Piezo通道的機(jī)械門控機(jī)制，并提出了系列模型假說，譬如“杠桿模型”假說：胞內(nèi)的長桿結(jié)構(gòu)可作為杠桿撬開孔道[22, 29]。此外，蛋白上各個(gè)結(jié)構(gòu)域的潛在作用也被逐步揭示：槳葉可以作為機(jī)械力傳導(dǎo)模塊[30]；錨定區(qū)（anchor）后的連接（linker）作用很關(guān)鍵：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白SERCA可通過它抑制Piezo[31]，而E-cadherin蛋白可通過它將Piezo和細(xì)胞骨架聯(lián)系在一起而增強(qiáng)Piezo功能[32]；帽子區(qū)可感知、傳導(dǎo)機(jī)械力，并且決定了Piezo通道從打開到失活過程的快慢[25, 30]；長桿區(qū)之后的“門塞”序列可通過“門塞和閂鎖”機(jī)制完成Piezo三個(gè)胞內(nèi)側(cè)向通路的協(xié)調(diào)門控[33]。

期待有朝一日，我們能獲得Piezo通道從關(guān)閉到開放再到失活等全部狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)以及在細(xì)胞膜上的原位結(jié)構(gòu)，能將上述各種學(xué)說囊括入一個(gè)“大統(tǒng)一”框架內(nèi)。

圖7. 推測的Piezo通道響應(yīng)機(jī)械力而開放的模型

Piezo通道的側(cè)面視角，為便于查看，Piezo三聚體簡化為兩個(gè)亞基。紅色虛線箭頭和實(shí)線箭頭分別代表離子不通透和通透的狀態(tài)。（圖片改編自Jiang, et al., 2021, Trends Biochem Sci[34]）

（未完待續(xù)）

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作者介紹

劉文豪，清華大學(xué)生命學(xué)院2016級PTN項(xiàng)目博士生，師從肖百龍教授。博士期間主要從事機(jī)械門控Piezo通道結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的研究，曾以共同第一作者在Nature、Neuron發(fā)表文章揭示Piezo通道機(jī)械門控過程的“雙門控”機(jī)制和“門塞和閂鎖”機(jī)制。